蛋白质沉淀分离技术的应用

蛋白质沉淀分离技术的应用1133120106 封义嘉 应用化学1101B班摘要蛋白质作为功能性物质常存在于复杂的混合体系中因此需要将其从原料中分离纯化蛋白质是一种不稳定的有机高分子物质。蛋白质的沉淀分离在我们的现实中，生产生活中具有很大的意义关键词蛋白质分离沉淀蛋白质（protein是生命的物质基础，没有蛋白质就没有生命。因此，它是与生命及与各种形式的生命活动紧密联系在一起的物质。机体中的每一个细胞和所有重要组成部分都有蛋白质参与。蛋白质占人体重量的16%~20%，即一个60kg重的成年人其体内约有蛋白质9.6~12kg人体内蛋白质的种类很多，性质、功能各异，但都是由20多种氨基酸按不同比例组合而成的，并在体内不断进行代谢与更新。一，蛋白质的沉淀分离1、蛋白质的盐析中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此称盐溶;当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称盐析，将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子如硫酸铵的SO4和NH4）有很强的水化力，可夺取蛋白质分子的水化层，使之“失水”，于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。盐析时若溶液pH在蛋白质等电点则效果更好。由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样，因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀盐析沉淀法在实验研究中有广泛的应用，如小牛胸腺末端脱氧核苷酰转移酶的分离纯化、磷酸酪氨酸蛋白专一抗体的纯化、雪旺细胞分泌神经营养蛋白的提纯、I-型胶原蛋白的提纯、红茶抗菌蛋白纯化、褐云玛瑙螺蛋白腺中糖蛋白分离纯化等。但这种方法需要用大量的无机盐，大规模使用会造成环境污染，为此需要进行复杂的污水处理。2、 等电点沉淀法蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力最小，因而溶解度也最小，各种蛋白质的等电点有差别，可利用调节溶液的pH达到某一蛋白质的等电点使之沉淀，如在硫酸铉沉淀中那样相互作用，形成聚集体。实际操作中，当蛋白等电沉淀所需pH值与提取缓冲液的pH值相差甚远时，等电沉淀也能进行。如碱性蛋白质可在酸性条件下溶解并在较高pH值条件下沉淀。具有中性等电点的蛋白质虽在中性pH值附近的缓冲液中能溶解，但很难或不可能用中性等电点来沉淀蛋白质，此时通过蒸馏水透析可沉淀这种蛋白。等电沉淀在适宜条件下也可用于高纯度生物大分子的制备等3、 低温有机溶剂沉淀法用与水可混溶的有机溶剂，甲醇，乙醇或丙酮，可使多数蛋白质溶解度降低并析出，此法分辨力比盐析高，但蛋白质较易变性，应在低温下进行4亲和沉淀法这种新方法既有亲和层析的优点，又更简便。原理是含敏感促进因子的亲和高分子材料与分离日标蛋白在其均相溶液中形成复合物，改变pH值、温度或离子强度，使复合物沉淀并对其进行解离，则亲和高分子材料分离出去，得到日标蛋白。亲和性的热沉淀高分子能很简便地分离制备蛋白。如将1%的亲和性热沉淀高分子材料与含有溶菌酶和卵清蛋白的溶液混合，20°C下孵化16h，孵化过程中维持搅拌，使其与蛋白形成复合物，然后将温度升至沉淀临界点，析出沉淀，离心分离，再将沉淀溶解在稀的醋酸溶液中，升高温度至临界析出点，将亲和性的热沉淀高分子沉淀出来，离心去除这些沉淀物就能得到溶菌酶和卵清蛋白。二应用盐析法，在蛋白质溶液中加入大量的中性盐以破坏蛋白质的胶体稳定性而使其析出，这种方法称为盐析。常用的中性盐有硫酸铉、硫酸钠、氯化钠等。各种蛋白质盐析时所需的盐浓度及pH不同，故可用于对混和蛋白质组分的分离。例如用半饱和的硫酸铉来沉淀出血清中的球蛋白，饱和硫酸铉可以使血清中的白蛋白、球蛋白都沉淀出来，盐析沉淀的蛋白质，经透析除盐，仍保证蛋白质的活性。调节蛋白质溶液的pH至等电点后，再用盐析法则蛋白质沉淀的效果更好。盐析法分为两类，第一类叫Ks分段盐析法，在一定PH和温度下通过改变离子强度实现，用于早期的粗提液；第二种叫b分段盐析法，在一定离子强度下通过改变PH和温度来实现，用于后期进一步分离纯化和结品。影响盐析的因素包括：蛋白质浓度、离子强度和类型、PH值、温度等。针对温度这一条，需要强调：在低离子强度或纯水中，蛋白质溶解度在一定范围内随温度增加而增加。但在高浓度下，蛋白质、酶和多肽类物质的溶解度随温度上升而下降。在一般情况下，蛋白质对盐析温度无特殊要求，可在室温下进行，只有某些对温度比较敏感的酶要求在0-4°C进行。使用硫酸铉沉淀蛋白需要注意：硫酸铉中常含有少量的重金属离子，对蛋白质巯基有敏感作用，使用前必须用H2S处理：将硫酸铉配成浓溶液，通入H2S饱和，放置过夜，用滤纸除去重金属离子，浓缩结品，100C烘干后使用。另外，高浓度的硫酸铉溶液一般呈酸性（PH=5.0左右），使用前也需要用氨水或硫酸调节至所需PH。有机溶剂沉淀法——多用于生物小分子、多糖及核酸产品的分离纯化；有机溶剂的沉淀机理是降低水的介电常数，导致具有表面水层的生物大分子脱水，相互聚集，最后析出。该法优点在于：1）分辨能力比盐析法高，即蛋白质或其它溶剂只在一个比较窄的有机溶剂浓度下沉淀；2）沉淀不用脱盐，过滤较为容易；3）在生化制备中应用比盐析法广泛。但是，在常温下，有机溶剂沉淀蛋白质往往引起变性。例如酒精消毒灭菌就是如此。因此，操作要求在低温下进行。有机溶剂的选择首先是能和水混溶，使用较多的有机溶剂是乙醇、甲醇、丙酮，还有二甲基甲酰胺、二甲基亚飒、乙腊和2-甲基-2,4戊二醇等。等电点沉淀法一一此法单独应用较少，多与其它方法结合使用；两性电解质分子上的净电荷为零时溶解度最低，不同的两性电解质具有不同的等电点，以此为基础可进行分离。如工业上生产胰岛素时，在粗提液中先调PH8.0去除碱性蛋白质，再调PH3.0去除酸