蛋白质分离纯化实验报告模板

高级生物与分子生物学实验报告姓名:学号：指导老师:实验一：重组pGEX-X载体的构建及表达【实验原理】：DNA连接原理：本实验将表达载体和PCR产物X进行双酶切，经琼脂糖凝胶后，割胶分离纯化的目的基因和线性化质粒，用T4DNA连接酶连接表达融合蛋白的重组质粒。大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的原理：经氯化钙处理的大肠杆菌，受短暂的热刺激后，可形成易于接受环状质粒DNA的感受态细胞。由于不同的质粒可带有不同的抗生素抗性基因(本实验质粒带有卡那霉素抗性基因)，根据转化菌的耐药特性进行删选。裂解法小量制备质粒DNA的原理：SDS和NaOH使蛋白质和染色体DNA变性；醋酸盐使变性蛋白、染色体DNA及SDS沉淀，质粒DNA存在于上清液中；乙醇可使质粒DNA沉淀，酚、氯仿去除残留的蛋白质。重组质粒鉴定的原理：对所有的重组质粒用限制性内切酶酶切，酶切产物行凝胶电泳以鉴定质粒DNA。组质粒的诱导表达的原理：Ptac启动子受lac阻遏物所调控，该启动子需要加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTP)进行诱导°IPTP的终浓度为1mmol/Lo融合蛋白的表达检测的原理：经诱导表达的重组体裂解后，经SDS鉴定。染色后明显出现目的蛋白带，而未经诱导的菌无此蛋白带。【实验步骤】：配制LB和LK培养基连接：质粒片断+目的基因（1.5m1离心管），16°C水浴过夜，65°C水浴10min,灭火连接酶。TOC\o"1-5"\h\zddH2O 12u1X-DNA（目的基因） 3u1pET-28a（质粒片断）2u110Xbuffer 2u1T41igase 1u1复苏DH5a和BL21,并接种DH5a1支，接种BL211支（10u1菌液+2m1LB）于试管，第二天7：30分别转接DH5a和BL21（1m1+20m1LB）于烧瓶。（分别准备制备感受态，两个连接反应用来转化）DH5a和BL21感受态细胞的制备：在烧瓶孵育2.5h后，取1.5m1菌液至1.5m1离心管，4000rmp，5min，弃上清，加500u1100mmo1/1CaC12，混匀，离心4000rmp，5min，弃上清，加500u1100mmo1/1CaC12，混匀，冰浴30min，离心（4C，4000rmp，5min），弃上清。加100u1100mmo1/1CaC12,重新悬浮沉淀。转化：另取1.5m1离心管，加连接反应液20u1，再加50u1DH5a和BL21感受态细菌，混匀，冰浴30min。42C水浴90s，再冰浴

1-2min。加500ulLB,37°C摇床培养1h。5000rpm,离心3分钟倒上清，重悬沉淀。涂板，37度过夜培养（DH5a：感受态一块LB,感受态一块LK转化菌一块LK,BL21同样）检查细菌生长情况，只有转化菌才能在含卡那霉素的培养基生长k 密集生长IJkI无细菌生长T）I均匀分布,质粒提取-碱裂解法1.51.5菌液I离心,SOOOrpm.3分钟弃上清（充分）沉淀，加1005溶液£|充分混匀,冰上.5分钟加200ljI溶液II颤倒混匀1轻柔）I桃上5分钟加1505溶液III|颠倒混匀，；水上5分钟J离心，12000rpm,分钟用枪吸40OuE上清至新管加1mI无水乙醇，混匀'冰上5-10分钟［离心，UOOOrpm,10分钟沉淀,加入1ml70%酒精|离心，1200rpm,S分钟弃上清|1200rpm瞬酎禹心用枪吸取残余液体|开盖，晾5-1。分钟沉淀，加20uSTE+1ulRP4Aase质粒酶切反应：在1.5ml离心管中加入以下物质，充分混匀后，瞬时离心，37度保温1-2小时

单酶切（ul）双酶切（ul）ddH2O141310xbuffer2ul2质粒3ul3BamHI11XhoI/1Total2020琼脂糖凝胶电泳：溶胶（用TAE缓冲液，充分融化），稍冷却后倒胶，加样（样品要加样品缓冲液至1x），电泳（1-10V/CM），染色与观察拍照。蛋白诱导表达：（BL21）2的过夜培养菌液转移1ml至30ml培弄基1r37度建荡培养3小时I 加IPTG至CLl-ImM取样1甸至1.5ml离心管37度震荡培养1小时1取样。，神至1,5ml离心管437度震询r］培弟2小时取样0.5m［至1.离心管12.SDS过程①配胶

制备分离胶(12%)制备浓缩胶(5%)dH2O制备分离胶(12%)制备浓缩胶(5%)dH2O：3.3ml30%丙烯4.0mltOMTris-CI(pH8.8)：2.5m110%SDS：OJml10%过硫酸铉：0.1mlTEMED：0.005ml样品制备dH20:3.4ml30%丙烯0.85mll1MT「isCI(pH5.8):0.625m110%SDS：0.05ml!10%过硫酸诲0.06ml!TEMED：0.005ml蔑液|离心,4000甲m5分钟弃上清再120Croni瞬时离心I用枪吸去上清，加505H少重悬沉淀［加入50ul2xSDS样品缓冲液混匀后至沸水浴中煮3-5分钟I4度或-20度保存加样电泳(200V)染色：考马斯亮蓝染色或银染【实验结果】：重组质粒的鉴定

空双单质M双单质【实验分析】：⑴在重组质粒酶切鉴定图谱中，第一加样泳道为DNAmarker,接下来的三泳道依次为：没有经过酶切的重组质粒加样泳道，双酶切的重组质粒加样泳道，单酶切的重组质粒加样泳道。经过分析，经单酶切的重组质粒两片段的分子量大小分别符合载体pET28a（+）和目的基因X的大小，即重组质粒构建基本成功。但是，每一泳道都有拖尾，这可能是酶切时间过短，使酶切不彻底，也可能是限制性内切酶活性不高，未放于冰上，使其酶切效果不佳。也有可能是胶制作不理想或者电解液不纯所造成。总之，能引起跑胶拖尾的原因很多，必须每一步都正规操作，尽量防止这种情况的出现。⑵在不同时间间隔IPTG诱导重组质粒表达蛋白图中，从左边起的第一至第三泳道分别是时间间隔为0h,1h,2h重组质粒经异丙基硫代半乳糖苷(IPTP)诱导在BL-21细胞中蛋白表达后用考马斯亮蓝染色的图示，可以看出蛋白表达量依次增多。实验二：脲酶的分离纯化及比活性测定【实验仪器、试剂】：仪器：层析柱^1.2cmX20cm恒温水浴箱751或者752紫外分光光度计721分光度计试剂：1、 3%尿素2、 0.1mol/LpH6.8的磷酸盐缓冲液3、 1mol/LHCl4、 32%丙酮溶液5、 纳氏试剂6、 0.001mol/L标准硫酸铵溶液【实验原理】：蛋白质（酶）是非常重要的生物大分子，其性质差异很大。蛋白质的分离和提纯工作室一项艰巨而又复杂的任务。到目前为止，还没有一个单独的或一套现成的方法能把任何一种蛋白质从复杂的混合物中提取出来，但对于任何一种蛋白质都可能选择一套适当的分离提纯程序来获取高纯度的制品脲酶分子量较大，达490kD。当脲酶粗制品通过交联葡聚糖SephadexG-200层析柱时，此酶本身不能进入凝胶颗粒的网络内。而其它小分子物质及分子量较小的蛋白质可扩散进入凝胶颗粒，因此，用蒸馏水作为洗脱剂，分子量大的脲酶首先被洗脱下来，从而达到与其他物质分离的目的。定时或定量收集洗脱液，分别在752分光光度计282nm波长测定其吸光度，再分别测定洗脱峰内各管的酶活性，以酶活性为纵坐标，以管号为横坐标，会出酶活性曲线，酶活性与蛋白质洗脱曲线中峰值重叠的部分即为分离所得到的脲酶所在部位。酶活性测定系根据酶催化尿素水解释出氨和CO2作用。

反应1服萌CO(NH2)^反应1服萌CO(NH2)^+h2o*2NHa+CO2反应2NH4OH+2(Hgl2-2KI)+3NaOHV >奈氏试剂ZH\fONH2l■+4KI+3Nal+3H£O*硫代双汞京(黄色)豚酶活性高 生成氨就多 *黄色亦深【实验步骤】：制备脲酶粗提液称0.5克黄豆粉于小三角瓶中I加2,5巾132%丙酮.震荡10min-I离心3000转，10分钟I上清液转至新离心管，加4倍体积冷丙酮I离心3000转，5分钟I沉淀，待丙酮挥发后，加L2血蒸僧水溶解离心3000转，10分钟I上清/粗提液凝胶过滤层析装柱：保持竖直，防分层、干裂平衡：装好后用蒸馏水平衡加样：加0.6ml粗提液洗脱与收集：用蒸馏水洗脱，3ml/15分钟/管，收集12管蛋白质含量检测蛋白质活性检测【实验结果】：1.硫酸铵标准曲线绘制:管号试剂12345670.001M硫酸铵(ml)0.10.20.30.40.50.6-含NH3的微克分子数0.20.40.60.811.2-H2O(ml)2.92.82.72.62.52.43混 匀奈氏试剂0.75ml,立即混匀A4800.5481.0481.5751.8342.4242.86202.蛋白含量测定:3.酶促反应：|洗脱液 粗提液空白[ | [ | ||II|1 2 3 …9 101112(1:20稀

释）3%尿素(ml)0.50.50.50.5).50.50.50.5().50.50.1MPBS1.01.01.01.01.01.01.01.0:.01.037度保温15分钟酶液――0.50.50.50.50.50.50.50).50.5H2O0.5混匀，37度保温15分钟向各管加入1MHCl0.5ml,放置5分钟，加1MNaOH0.5ml终止反应4.显色与测定空白洗脱液粗提液（1:20稀释）123456789101112上述反应液0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.1H2O奈氏试剂 每管加0.75ml,混匀，测量480mm吸光度A480酶活性计算空 洗脱液 粗提

白123456789101112液(1:20稀释)A4800-0.0140.3754.2502.6852.8020.2150.4170.1360.0180.023-0.06NH3(umol)|活性/ml洗脱液活性/管［蛋白］(mg/ml)(x10-3比活性［单位：NH3(umol)数/mL［洗脱液・h］蛋白浓度(mg/ml)=A280x0.75活性/ml洗脱液=NH3(umol)数x3