分子遗传学纸板

第一节遗传物质的本质1868年，瑞士的内科医生FriedrichMiescher从外科医院包扎伤口的绷带上的脓细胞核中提取到一种富含磷元素的酸性化合物，将其称为核质或核素(nuclein)；后来他又从鲭鱼精子中分离出类似的物质，并指出它是由一种碱性蛋白质与一种酸性物质组成的，此酸性物质即是现在所知的核酸(nucleicacid)。FriedrichMiescher米歇尔（1844-1895）

一、遗传物质的发现当前第1页\共有80页\编于星期五\3点1889年，奥尔特曼(R.Altmann)首次提出了核酸(nucleicacid)的名称。1885-1901年，Kossel等证实核酸由A、G、C、U四种碱基。1911-1934年Levene等确定了核酸有两种，一种是脱氧核糖核酸(DNA)，另一种是核糖核酸(RNA)。证实核酸由不同的碱基组成。其最简单的单体结构是碱基-核糖-磷酸构成的核苷酸。科赛尔（1853-1927）

列文(1869-1940)

当前第2页\共有80页\编于星期五\3点核酸是遗传物质遗传物质必须具备哪些特点？1)在体细胞中含量稳定；2)在生殖细胞中含量减半；3)能携带遗传信息；4)能精确地自我复制；5)能发生变异；核酸(nucleicacid)

是以核苷酸为基本组成单位的生物大分子，携带和传递遗传信息。当前第3页\共有80页\编于星期五\3点遗传物质的主要载体-染色体。

（通过对细胞有丝分裂、减数分裂和受精过程的研究，人们了解到染色体在生物的传宗接代过程中，能够保持一定的稳定性和连续性。因此，人们认为染色体在遗传上起着主要作用。）2.DNA是主要的遗传物质-除了少数的RNA病毒之外，DNA几乎是所有生物遗传信息的携带者。

(染色体的主要成分是DNA和组蛋白，虽然这两种成分都在基因功能上起着重要的作用，但多数证据证明，基因的主要特性由DNA决定，或者说遗传信息贮存在DNA中)。3.DNA是遗传物质的证据。

如果DNA确是遗传物质,那么能不能把DNA和蛋白质分开，单独观察DNA的作用呢？这些实验已在微生物中做了,证明遗传物质确是DNA（或RNA）。

证据：当前第4页\共有80页\编于星期五\3点FrederickGriffith格里菲斯(1879-1941)

利用肺炎双球菌感染小鼠的一系列生物学实验，发现了一种可以在细菌之间转移的遗传分子，即转化因子格里菲斯实验

1928年FrederickGriffith

转化实验5当前第5页\共有80页\编于星期五\3点

1944年Avery等人通过肺炎球菌转化实验证明DNA是携带遗传信息的分子OswaldTheodoreAvery埃弗里（1877-1955）DNA分子中贮存着遗传信息6当前第6页\共有80页\编于星期五\3点人们仍不相信DNA是遗传物质,

这是由于：（1）因认为蛋白分子量大，结构复杂，二十种氨基酸的排列组合将是个天文数字，可作为一种遗传信息。而DNA分子量小，只含4种不同的碱基，人们一度认为不同种的有机体的核酸只有微小的差异。（2）认为转化实验中DNA并未能提得很纯，还附有其它物质。（3）即使转化因子确实是DNA，但也可能DNA只是对荚膜形成起着直接的化学效应，而不是充当遗传信息的载体。当前第7页\共有80页\编于星期五\3点1952年，Hershey和Chase

完成噬菌体感染实验当前第8页\共有80页\编于星期五\3点RNA也是遗传物质1956年吉尔(A.Gierer)和施拉姆(G.Schraman)发现烟草花叶病毒（tobaccomosaicvirus,TMV）的遗传物质是RNA1957年美国的弗伦克尔-康拉特(Fraenkel-Conrat)和B.Singre用病毒重建实验证实了这一结论HeinzLudwigFraenkel-ConratAlfredGierer9当前第9页\共有80页\编于星期五\3点

烟草花叶病毒是一种RNA病毒，不含DNA，它有一个圆筒状的蛋白质外壳，由2130个相同的亚基组成，内有一条RNA分子，沿着内壁在蛋白质亚基之间盘旋

10当前第10页\共有80页\编于星期五\3点1889年，奥尔特曼(R.Altmann)首次提出了核酸(nucleicacid)的名称。1885-1901年，Kossel等证实核酸由A、G、C、U四种碱基。1911-1934年Levene等确定了核酸有两种，一种是脱氧核糖核酸(DNA)，另一种是核糖核酸(RNA)。证实核酸由不同的碱基组成。其最简单的单体结构是碱基-核糖-磷酸构成的核苷酸。科赛尔（1853-1927）

列文(1869-1940)

二、DNA和RNA的化学组成当前第11页\共有80页\编于星期五\3点1929年Levene和London提出四核苷酸假说：“不同DNA的成分都是相同的”。1948年AlfredMirsky，HarsRis＄R.Vendrely，A.Boivin两组学者分别发现不同的生物体细胞中DNA的含量都是其配子中的两倍。

1950[英]Chargaff对各种生物DNA的碱基组成进行了定律测定，发现DNA的“当量规律”即：嘌呤的总含量和嘧啶的总含量相等；且不同生物DNA碱基组成有明显差异。否定了四核苷酸假说，提示了A-T、G-C

互补的可能性。

当前第12页\共有80页\编于星期五\3点核酸的分类及分布

存在于细胞核和线粒体内。存在于胞核、胞液和线粒体。(deoxyribonucleicacid,DNA)(ribonucleicacid,RNA)脱氧核糖核酸核糖核酸携带遗传信息，决定细胞和个体的遗传型(genotype)。参与遗传信息的复制与表达。某些病毒RNA也可作为遗传信息的载体。核酸(nucleicacid)

是以核苷酸为基本组成单位的生物大分子，携带和传递遗传信息。13当前第13页\共有80页\编于星期五\3点核酸的基本组成单位是核苷酸(nucleotide)碱基戊糖磷酸核苷酸核苷核酸DNA的基本组成单位是脱氧核糖核苷酸。RNA的基本组成单位是核糖核苷酸。元素组成：C、H、O、N、PP元素的含量较多并且恒定，约占9～11%。14当前第14页\共有80页\编于星期五\3点嘌呤

嘧啶

碱基腺嘌呤（A）鸟嘌呤（G）胞嘧啶（C）胸腺嘧啶（T）尿嘧啶（U）DNA、RNA均有DNA有RNA有每种核酸都含有四种碱基。（一）碱基15当前第15页\共有80页\编于星期五\3点嘧啶嘌呤16当前第16页\共有80页\编于星期五\3点除了上述五类基本的碱基外，核酸中还有一些含量甚少的碱基，称为稀有碱基。稀有碱基种类极多，大多数都是甲基化碱基。tRNA中含有较多的稀有碱基。生物体内游离存在的嘌呤碱基稀有碱基17当前第17页\共有80页\编于星期五\3点

五种碱基都能形成酮式-烯醇式或氨基-亚氨基的互变异构。这两种异构体的平衡关系受介质酸碱环境的影响。

18当前第18页\共有80页\编于星期五\3点

一些合成的嘌呤和嘧啶具有临床应用价值，它们可以取代某些酶活性部位中的天然嘧啶和嘌呤底物。例如5-氟尿嘧啶和6-巯基嘌呤就常用于治疗某些类型的癌症。5-氟尿嘧啶相应的核苷酸类似于胸苷酸，是一种潜在的胸苷酸合成酶的抑制剂，胸苷酸合成酶是DNA合成所必需的酶。次黄嘌呤19当前第19页\共有80页\编于星期五\3点（二）戊糖（构成RNA）核糖(ribose)（构成DNA）脱氧核糖(deoxyribose)'''''''''β-D-呋喃核糖β-D-2-脱氧呋喃核糖20当前第20页\共有80页\编于星期五\3点碱基和核糖（或脱氧核糖）通过糖苷键连接形成核苷（或脱氧核苷）。（三）核苷（nucleoside）RNA腺苷、鸟苷尿苷、胞苷DNA脱氧腺苷、脱氧鸟苷脱氧胸苷、脱氧胞苷21当前第21页\共有80页\编于星期五\3点（四）核苷酸（nucleotide）

核苷酸就是核苷的磷酸酯。是核苷中的戊糖上C5'相连的羟基被磷酸分子酯化所形成的。22当前第22页\共有80页\编于星期五\3点一个核苷酸3的羟基与另一个核苷酸5的α-磷酸基团缩合形成磷酸二酯键(phosphodiesterbond)

多个脱氧核苷酸通过磷酸二酯键构成了具有方向性的线性分子，称为多聚核苷酸，即DNA链或RNA链（四）核苷酸之间通过3,5-磷酸二酯键连接23当前第23页\共有80页\编于星期五\3点交替的磷酸基团和戊糖构成了DNA的骨架(backbone)。DNA链的方向是5→324当前第24页\共有80页\编于星期五\3点脱氧核糖核酸和核糖核酸的比较分类核糖核酸（ribonucleicacid，RNA）脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid，DNA）组成戊糖核糖脱氧核糖碱基A,G,CA,G,CUT磷酸Pi（磷酸二酯键）Pi（磷酸二酯键）结构单链，部分碱基互补，局部双螺旋，三叶草形等双链，碱基互补，双螺旋形分布细胞核（核仁），细胞质（线粒体、核蛋白体、胞液）细胞核（染色质），细胞质（线粒体）生物功能主要参与遗传信息的传递和表达过程，在蛋白质的生物合成中起重要作用是基因遗传与表达的载体，是生物的主要遗传物质25当前第25页\共有80页\编于星期五\3点DNA的一级结构是指脱氧核苷酸之间的连接方式和排列顺序。由于核苷酸间的差异主要是碱基不同，所以也称为碱基序列。5’5’3’3’一、DNA的一级结构第二节DNA的结构和性质26当前第26页\共有80页\编于星期五\3点化学式…PAPCPGPT…或…PA-C-G-T…

…ACGT…多聚核苷酸链具有方向性，若不特别注明，一般规定从5‘端书写至3’端。线条式文字式双链DNA的两条链为反向平行，必须注明各条链的走向。核酸的表示方式27当前第27页\共有80页\编于星期五\3点生物的遗传信息贮存于DNA碱基序列中，生物界的多样性即寓于DNA分子中的4种脱氧核苷酸千变万化的精确排列顺序中。基因的遗传信息的物质基础就是4种碱基的精确排列顺序。可以通过测定DNA序列来研究DNA所载的信息及其功能。DNA一级结构的意义：28当前第28页\共有80页\编于星期五\3点

根据碱基配对原则，当一条多核苷酸链的序列被确定后，即可决定另一条互补链的序列。这就表明，遗传信息由碱基的序列所携带。DNA碱基配对示意图29当前第29页\共有80页\编于星期五\3点（一）DNA双螺旋模型的诞生Watson&Crick建立双螺旋模型主要是受到4个方面的影响：（1）1938年W.T.Astbury&Bell用x衍射技术研究DNA。1947年拍摄了第一张DNA的衍射照片，并推断DNA分子的结构是：

①柱状；②多核苷酸是一叠扁平的核苷酸；③核酸残基取向和分子长轴垂直，间距为3.4nm。（2）1951年Pauling和Corey运用化学的定律来推理，而不做具体的实验，建立了蛋白质的α-螺旋模型。（3）晶体学者[美]J.Donohue

&Chargaff

的指点纠正起初的同类碱基配对的错误构想，而提出互补配对的正确构型。（4）R.Franklin&Wilkins在1952年底拍得了DNA结晶X衍射照片。二、DNA的二级结构——双螺旋结构当前第30页\共有80页\编于星期五\3点（二）双螺旋模型(doublehelixmodel)双螺旋模型有以下特点：（要求）(1)DNA分子由两条反向平行的多核苷酸链组成，形成右手双螺旋。(2)两条链反向平行其5´和3´方向相反。(3)双螺旋直径2nm；螺距3.4nm；上下相邻碱基的垂直距离0.34nm，交角为36▫；每个螺旋有10个碱基对。(4)糖一磷酸链是在双螺旋的外侧，碱基对与轴线垂直。(5)糖与附着在糖上的碱基近于垂直。(6)碱基配对时，必须一个是嘌呤，另一个是嘧啶。(7)DNA双螺旋有大沟(majororwidegroove)和小沟(minorornarrowgroove)的存在。当前第31页\共有80页\编于星期五\3点模型中的碱基配对有何重要性？（要求）A-T,G-C配对可形成很好的线性氢键；A-T对和G-C对的几何形状一样，使双链中两侧脱氧核糖之间的距离相近，使双螺旋保持均一；碱基对处在同一平面内垂直于对称轴，沿对称轴旋转180º仍保持原对称性，不论核苷酸的顺序如何，都不影响双螺旋的结构，其外形都是光滑均匀的圆柱体；模型中碱基对处于同一平面，但实际其存在一个小角度的扭转，称螺旋桨式扭转，使相邻碱基间的重叠面积大，增加了碱基间的堆集力，增强了双螺旋的稳定性；为DNA半保留复制奠定了基础。当前第32页\共有80页\编于星期五\3点（三）DNA二级结构的稳定因素（要求）DNA二级结构的稳定因素(1)碱基对之间的氢键。(2)碱基的堆集力。它包括：①疏水作用；②范德华力；③磷酸基的负电荷斥力；

(3)核苷酸的磷酸基团上都带有负电荷33当前第33页\共有80页\编于星期五\3点1.两条DNA链之间碱基对形成的氢键（hydrogenbond）：使四种碱基形成特异配对关系，G-C间可形成3对氢键，A-T之间有两对氢键。虽然氢键是一种弱键，但DNA中氢键数量多，所以氢键是比较重要的因素。2.碱基堆积力（basestackingforce）：双螺旋结构内部碱基层层堆积，形成了一个强大的疏水区，消除了介质中水分子对碱基之间氢键的影响。这是维持DNA双螺旋稳定的主要因素。3.介质中的阳离子（如Na+、K+和Mg2+）可与磷酸基团上的负电荷形成离子键，降低了DNA链之间的排斥力、范德华引力等，有利于双螺旋的稳定。当前第34页\共有80页\编于星期五\3点DNA二级结构的稳定因素与Tm值(1)碱基对之间的氢键碱基对数越多双链越稳定（Tm越大），在设计PCR引物时，最少16nt，最好为20-24nt(2)碱基堆集力碱基间相互作用强度与相邻碱基之间的环面积成正比，即：嘌呤与嘌呤>嘌呤与嘧啶>嘧啶与嘧啶即DNA链中嘧啶越多Tm值越低，反之嘌呤越多Tm越高，链越稳定。(3)核苷酸的磷酸基团上都带有负电荷与介质中盐离子结合屏蔽静电排斥作用，使链稳定盐离子浓度降低，屏蔽减弱，Tm降低盐离子浓度大于生理盐水，随浓度增加，Tm增加35当前第35页\共有80页\编于星期五\3点

Watson和Crick所描述的双螺旋结构是B型DNA，是在生理条件下（低浓度盐溶液中）的构型，其仅仅是众多DNA双螺旋构象中的一种。在外界条件的改变下，双螺旋的构象也会改变。三、双螺旋结构的构象变异当前第36页\共有80页\编于星期五\3点（一）DNA构象的类型DNA的构象现已知有：A，B，C，D，E，T，Z

7种。

引起DNA双链构象改变有以下因素：（1）核苷酸顺序；（2）碱基组成；（3）盐的种类；（4）相对湿度。当前第37页\共有80页\编于星期五\3点目前已知DNA双螺旋结构可分为A、B、C、D及Z型等数种，除Z型为左手双螺旋外，其余均为右手双螺旋。

Z-DNA B-DNA

当前第38页\共有80页\编于星期五\3点A，B，Z型DNA构象的比较B型结构：右手双股螺旋；碱基在内，戊糖在外，碱基平面垂直于螺旋轴；螺旋轴穿过碱基对；双螺旋每转一周为10个碱基对；大沟宽而深，小沟窄而浅。A型结构：右手双股螺旋，每圈11个碱基对；碱基平面倾斜20º，螺旋轴位于大沟，小沟宽而浅，大沟极深；螺旋变粗变短，螺距2～3nm。Z型结构：左手螺旋，每圈12个碱基对；碱基平面倾斜9º，螺旋轴位于小沟，没有大沟，小沟窄而深。

在生理溶液中，B-DNA与Z-DNA可以互变。39当前第39页\共有80页\编于星期五\3点当前第40页\共有80页\编于星期五\3点1.右手螺旋B-DNA:相对湿度92%，钠盐—细胞内主要的存在形式A-DNA:相对湿度75%，钠盐—转录时DNA-RNA

杂交C-DNA:相对湿度66%，锂盐—染色体及某些病毒的DNA中2.左手螺旋Z-DNA：常存在于基因的调控区域，可能与基因的表达调控有关。

DNA双螺旋结构的多样性41当前第41页\共有80页\编于星期五\3点1972年Pohl

etal发现poly(dG-dC)在高盐下旋光性发生改变；1979年WangA.H-J(王惠君),A.Rich对d(CGCGCG)单晶作X衍射分析提出Z－DNA模型（二）Z型DNA构象1.Z-DNA的发现：42当前第42页\共有80页\编于星期五\3点（1）糖磷骨架呈“之”字形（Zigzag）走向。（2）左旋。（3）G的糖苷键呈顺式，使G残基位于分子表面。（4）分子外形呈波形。（5）无大小沟区分，沟窄而深。（6）每个螺旋有12bp。2.Z-DNA的结构特点(要求)当前第43页\共有80页\编于星期五\3点3.Z－DNA存在的条件：

(1)高盐：NaCl>2Mol/L,MgCl2>0.7Mol/L(2)嘌呤-嘧啶相间排列：现认为在适当的离子存在条件下，任何不少于6个bp的嘌呤-嘧啶交替排列序列都能形成Z-DNA(3)在活细胞中如果m5C（甲基化胞嘧啶）存在，则无需嘌呤-嘧啶相间排列，在生理盐水的浓度下即可产生Z型。(4)在体内多胺化合物，如和亚胺及亚精胺和阳离子一样，可和磷酸基因结合，减少负电荷的静电排斥作用，使B-DNA转变成Z-DNA。(5)某些蛋白质如Z-DNA结合蛋白带有正电荷，可使DNA周围形成局部的高盐浓度和微环境，也是活细胞中形成Z-DNA的原因之一。(6)负超螺旋的存在当前第44页\共有80页\编于星期五\3点4.Z-DNA的生物学意义（要求）(1)可能提供某些调节蛋白的识别位点。啮齿类动物病毒的复制起始部位有d（GC）有交替顺序的存在。(2)在SV40的增强子中有三段8bp的Z-DNA存在。(3)原生动物纤毛虫，它有大、小两个核，大核有转录活性，小核和繁殖有关。Z-DNA抗体以萤光标记后，显示仅和大核DNA结合，而不和小核的DNA结合，说明大核DNA有Z-DNA的存在，可能和转录有关。当前第45页\共有80页\编于星期五\3点1957年G.Felsenfeld等发现在基因的调控区或染色质的重组部位有DNA的三螺旋结构（三）其它DNA二级结构1.三链DNA46当前第46页\共有80页\编于星期五\3点三链DNA（triple-strandedDNA）

是DNA的一种特殊结构，由第三条寡核苷酸链通过Hoogsteen碱基配对和双螺旋中的一条链以特殊的氢键相连，形成三螺旋结构，又称三链体DNA（triplexDNA）。Hoogsteen碱基配对：1963年K.Hoogsteen发现三链DNA中的碱基能以不同于Watson-Crick配对的构象连接，即A的6-NH2和N-7分别与T的4-O和H-1形成氢键，G与C的配对要求C的N-1是质子化的，G的6-O和N-7分别与C的4-NH2和质子化的N-1形成氢键。应用：三螺旋DNA的形成可能伴随于DNA转录、复制和重组等过程。如在E.coli重组酶RecA作用中产生三链中间体，又称R-DNA。47当前第47页\共有80页\编于星期五\3点当前第48页\共有80页\编于星期五\3点生物学功能：可能参与端粒DNA的复制（三）其它DNA二级结构2.四链体DNA

是富含G序列的四链DNA所形成的一种结构。端粒的单链富含G的3突出端即能形成鸟嘌呤四连体。发现：1989年J.R.Williamson等用X射线在体外分析了哺乳动物端粒序列末端的一段150-200nt的单链富含G重复序列的晶体，发现其可形成特殊的四链结构，特别是在具有Na+和K+存在的情况下。49当前第49页\共有80页\编于星期五\3点当前第50页\共有80页\编于星期五\3点

所谓DNA的三级结构，是指在一二结构基础上的多聚核苷酸链上的卷曲。在一定意义上，DNA双螺旋进一步扭曲盘绕则形成其三级结构。三级结构包括链的扭结和超螺旋或者是单链形成的环或是环状DNA中的连环体。超螺旋是DNA三级结构的主要形式。

四、DNA的三级结构

超螺旋的发现：1965年J.Vinograd等人在离心分离多瘤病毒的环形DNA时，意外发现出现两条带，他认为一条是松弛性DNA，另一条可能是超螺旋DNA，从而发现了DNA的超螺旋。

当前第51页\共有80页\编于星期五\3点各种生物DNA的超螺旋现已知道绝大多数原核生物都是共价封闭环状(covalentlyclosedcircle,CCC)DNA分子，这种双螺旋环状分子再度螺旋化成为超螺旋结构(superhelix或supercoil)。有些单链环形DNA(如φ×174)或双链线形DNA(如噬菌体λ)，在其生活周期的某一阶段，也必将其变为超螺旋形式。对于真核生物来说，虽然其染色体多为线形分子但其DNA均与蛋白质相结合，两个结合点之间的DNA形成一个突环(loop)结构，类似于CCC分子，同样具有超螺旋形式。52当前第52页\共有80页\编于星期五\3点原核生物DNA的三级结构：绝大多数原核生物的DNA都是共价封闭的环状双螺旋。如果再进一步盘绕则形成麻花状的超螺旋三级结构。

当前第53页\共有80页\编于星期五\3点

超螺旋结构的类型松驰型DNA（relaxformDNA）超螺旋（Supercoiled

DNA）超螺旋结构：正超螺旋—拧紧状态负超螺旋—拧松状态（天然DNA主要以负超螺旋结构存在，以利于基因的表达）

负超螺旋（NegativeSupercoiled）：是指顺时针右手螺旋的DNA双螺旋以相反方向绕它的轴扭转而成，通过这种方式，调节了DNA双螺旋本身的结构，松解了扭曲压力，使每个碱基对的旋转减少，甚至可打乱碱基配对。当前第54页\共有80页\编于星期五\3点松驰结构正超螺旋负超螺旋55当前第55页\共有80页\编于星期五\3点

向左捻向右捻松弛型正超螺旋负超螺旋56当前第56页\共有80页\编于星期五\3点超螺旋概念的基本要点是：（１）初级螺旋处于松缠或紧缠状态；（２）与松弛形式相比具有额外的自由能。

这两点实际上是一种物理状态的两种表现。所有的生物的DNA都具有负超螺旋，它与许多生命过程密切相关。在溶液中和细胞内负超螺旋会部分地转变为单链泡状结构(下图)，这种单链泡状结构也是解除松缠作用造成的胁变的一种途径。57当前第57页\共有80页\编于星期五\3点单链泡状结构58当前第58页\共有80页\编于星期五\3点DNA超螺旋的产生机制

在原核生物中，负超螺旋主要由DNA旋转酶(DNAgyrase)引入到已存在的双链封闭环状分子中，此酶沿拓扑异构复制叉进行移动，靠解旋酶切断配对碱基，逐步解开DNA聚合酶前面的双螺旋。这一过程需要水解ATP以提供能量。在缺乏ATP时，DNA旋转酶也可使负超螺旋松弛，但是这个作用与超螺旋化作用比较起来要低10倍以上。原核细胞中，这一过程是由拓扑异构酶I和其他的拓扑异构酶II来负责的。59当前第59页\共有80页\编于星期五\3点在真核生物中，染色體DNA負超螺旋結構被組蛋白所固定，細菌染色體DNA負超螺旋結構被類組蛋白（HU，HD，NS1，NS2orDNAbindingproteinⅡ）固定；真核生物和細菌染色體未被蛋白結合的區域可分爲鬆弛與不完全鬆弛狀態，嗜熱古菌染色體DNA大部份爲鬆弛狀態，但它與DNA結合蛋白作用卻可使DNA裸露區呈超螺旋狀態。極端嗜熱古菌已經找出多種分子量爲7、8、10kDa的DNA結合蛋白。

DNA拓扑异构酶(topoisomerase)

:

拓扑：是指物体或图像作弹性移位而又保 持物体不变的性质。

拓扑异构酶：是一类可改变DNA拓扑性质 的酶。对DNA分子的作用是既能水解、又 能连接磷酸二酯键。可松弛DNA超螺旋， 有利于DNA解链。60当前第60页\共有80页\编于星期五\3点拓扑异构酶I（topoI）:又称切刻-封闭酶

(enicking-closingnzyme)。

在原核生物曾被称为－蛋白。主要作用是切开DNA双链中的单链(每次只作用一条链)，使DNA解链旋转中不打结，DNA变为松弛状态再封闭切口，不需能量因子ATP或NAD。

拓扑异构酶II（topoII）:

在原核生物又叫旋转酶(gyrase)。能切断DNA双链，使螺旋松弛。在ATP参与下，松弛的DNA进入负超螺旋，再连接双链断端。61当前第61页\共有80页\编于星期五\3点62当前第62页\共有80页\编于星期五\3点DNA超螺旋的产生机制在真核细胞中，DNA的负超螺旋则主要是染色质的结构造成的。因为DNA在组蛋白八聚体外面缠绕的方向有利于DNA向松缠方向转变。在核小体组装过程中，也肯定有DNA拓扑异构酶参加。在许多真核生物中部发现了拓扑异构酶Ⅰ和拓扑异构酶II。当前第63页\共有80页\编于星期五\3点常见的DNA分子形式一般以相同核苷酸的线形双螺旋DNA分子的沉降常数作为1，其他各种分子取相对值。沉降常数与电泳迁移率之间并不完全一致。I形DNA：具有负超螺旋或正超螺旋的双链封闭环状分子。相对沉降常数1.4l。I0形DNA：没有超螺旋的双链封闭环状分子，也就是松弛形式(relaxedform)，相对沉降常数1.14。II形DNA：在一条链上或两条链上有一个或几个切刻的双链环状分子，又称为切刻环(nickedcirle)，相对沉降常数1.14。Ⅲ形DNA：线形双螺旋分子。相对沉降常数1.00。64当前第64页\共有80页\编于星期五\3点坍缩DNA(collapsedDNA)：当I形成I0形DNA在碱变性或热变性时，其氢键断裂，而两条链无法分离，结果生成两条链紧密缠结的分子。坍缩DNA具有异常高的沉降常数，相对沉降常数约3.0。单链环状DNA：相对沉降常数大约为1.14。线性单链DNA：相对沉降常数为1.30。环连DNA(catenatedDNAcatenane):这是在DNA复制过程中的产物或由DNA旋转酶催化生成，由两个以上T形DNA分子环连而成。以上八种DNA分子形式的转变表示于下图，其中前四种仍标以I、I0、II、Ⅲ后四种则分别以(5)、(6)、(7)、(8)表示。

当前第65页\共有80页\编于星期五\3点66当前第66页\共有80页\编于星期五\3点当前第67页\共有80页\编于星期五\3点第三节DNA的变性与复性变性（denaturation）或解链（melting）

将双链DNA缓慢地加温，使其氢键断裂，双链解开，产生单链DNA分子的过程。复性（renaturation）或退火（annealing）

核酸分子在变性后，分开的互补链缓慢冷却，重新形成互补双连的过程。当前第68页\共有80页\编于星期五\3点1.下列因素可导致DNA变性：高温、酸、碱、尿素、甲酰胺

常用的方法是热变性法和碱变性法。2.DNA变性后物理性质发生的变化：（1）流体力学的性质发生改变：粘度下降，而沉降速度增加；（2）提高了对紫外线的吸收能力，此称为

增色效应（hyperchromiceffect）。3.增色效应(hyperchromicity)由于DNA变性而引起的光吸收的增加称为增色效应。双链DNA的A260=1.00（浓度为50μg/ml时，对波长260nm紫外线的吸收能力）；单链DNA的A260=1.37；游离碱基或核苷酸的A260=1.60。一、变性当前第69页\共有80页\编于星期五\3点4.DNA的熔解曲线解链温度（meltingtemperature,Tm）或熔点：

是A260的升高达到极大值一半时（一般约为1.185）的温度。即是变性温度范围的中点。是鉴定DNA的参量。DNA的熔解曲线：缓慢而均匀地增加DNA溶液的温度（一般0.1℃/min），记录各个温度下的A260数据，即可绘制DNA熔解曲线。从中可测出Tm影响变性的因素：外部条件：如温度和正离子的浓度。浓度低于0.4mol/L，单价阳离子增高10倍，Tm增加16.6°内部条件：GC含量及分子类型。当GC的含量上升1%，则Tm上升0.4℃。

马默多蒂（Marmur-Doty）关系式：

Tm=69.3+0.41(G+C)%，或GC%=（Tm-69.3）×2.44当前第70页\共有80页\编于星期五\3点二、复性1.复性的条件：

(1)有足够的盐浓度以消除磷酸基的静电斥力；NaCl：(2)有足够高的温度以破坏无规则的链内氢键。

一般比Tm低20-25℃2.复性的过程：

DNA的复性对片段有两个要求：(1)互补顺序的碰撞和排列；(2)碱基的正确配对和氢键的形成。具体过程分为：(1)成核作用：一般需10-20bp产生一个或几个双螺旋核心。(2)拉拉链作用。当前第71页\共有80页\编于星期五\3点3.复性动力学

C11C0