植物组织培养与器官培养

植物组织培养与器官培养2023/6/11第一页，共六十八页，编辑于2023年，星期日植物离体无性繁殖简称离体繁殖（invitropropagation)、微型繁殖（micropropagation)，是指利用离体培养技术将来自优良植株的茎尖、腋芽、叶片、鳞片等器官、组织和细胞进行离体培养，并在短期内获得大量遗传性一致的植株的方法（技术）。用这种方法得到的植株群体称单株无性系。(来自一个单株（或一个单芽），它们遗传组成相同)近400种植物离体繁殖已获成功。兰花、无子西瓜、马铃薯、杨树等已在种苗生产上广泛应用。第二页，共六十八页，编辑于2023年，星期日植物离体无性繁殖的意义（优越性）繁殖速度快，经济效益高占用空间小，不受地区季节限制，便于工厂化育苗可以繁殖各种珍稀、涉危苗木离体繁殖周期：1～3个月繁殖系数：几十～几百倍又称快繁离体繁殖是建立在体细胞系的基础上，是在人工控制的环境条件下，不会造成性状分离，也不会退化，同时还可避免病虫害的侵染。利于筛选突变体，为育种服务第三页，共六十八页，编辑于2023年，星期日手指玫瑰由根组织培养的蒲公英幼苗第四页，共六十八页，编辑于2023年，星期日植物离体无性繁殖的方式器官发生型(organogenesistype)胚状体发生型(embryogenesistype)不定芽型（adventitiousbudtype)器官型(organtype)原球茎型(protocormtype)球茎芽型块茎型鳞茎型孢子型根茎型

微枝扦插型

第五页，共六十八页，编辑于2023年，星期日器官发生型(organogenesistype)：诱导器官外植体产生愈伤组织，经分化培养形成芽、根再生成植株的方式。技术关键：外植体诱导产生的愈伤组织要早期挑选，使其来源尽量一致。特点：繁殖速度快；培养经愈伤组织阶段再生成植株，遗传性不稳定，易产生变异。芦荟、烟草、油菜等第六页，共六十八页，编辑于2023年，星期日无菌母株制备增殖、分化植株再生及鉴定炼苗和移植器官发生型基本程序培养基中激素配比激素种类及浓度基本培养基组成渗透压逐步过渡培养基筛选材料灭菌第七页，共六十八页，编辑于2023年，星期日胚状体发生型(embryogenesistype)：指植物器官、组织和细胞外植体经培养脱分化形成胚状体再成苗的方式。技术关键：提高不同外植体胚状体发生及萌发率和提高胚状体同步化率。特点：胚状体发生数量多、速度快、结构完整，繁殖系数高；遗传性稳定。甘蔗、胡萝卜、石刁柏等第八页，共六十八页，编辑于2023年，星期日不定芽型（adventitiousbudtype)：选取具有顶芽和腋芽的短枝无菌培养，诱导芽萌发成苗或增殖产生许多不定芽发育成苗，将新萌生的枝条再转接继代，重复芽到苗的增殖过程，最后使其生根形成植株的方式。技术关键：打破顶端优势，促使腋芽增殖并促其生根。特点：繁殖率高、保持物种的遗传稳定性，多用于林木的繁殖。FLash第九页，共六十八页，编辑于2023年，星期日器官型(organtype)指直接从茎、叶、鳞片等外植体上诱导不定芽或带芽的休眠器官（如小鳞茎、小球茎、小块茎）产生再生成植株的方式。技术关键：对培养基要求高，控制好激素浓度，避免愈伤组织发生。优点：繁殖率高，速度较快；遗传性稳定。三倍体无籽西瓜、甘蔗、香蕉、香石竹、丝石竹等第十页，共六十八页，编辑于2023年，星期日原球茎型(protocormtype)兰属特有的方式，即外植体经培养产生原球茎，再直接长成植株。第十一页，共六十八页，编辑于2023年，星期日球茎芽型叶柄表面产生圆球形小突起——球茎芽，一端出芽一端出根遗传性较稳定，球茎芽可直接放入土中种植观叶海棠球茎芽型叶柄表面产生圆球形小突起——球茎芽，一端出芽一端出根遗传性较稳定，球茎芽可直接放入土中种植观叶海棠球茎芽型叶柄表面产生圆球形小突起——球茎芽，一端出芽一端出根遗传性较稳定，球茎芽可直接放入土中种植观叶海棠球茎芽型叶柄表面产生圆球形小突起——球茎芽，一端出芽一端出根遗传性较稳定，球茎芽可直接放入土中种植观叶海棠球茎芽型叶柄表面产生圆球形小突起——球茎芽，一端出芽一端出根遗传性较稳定，球茎芽可直接放入土中种植观叶海棠球茎芽型叶柄表面产生圆球形小突起——球茎芽，一端出芽一端出根遗传性较稳定，球茎芽可直接放入土中种植观叶海棠球茎芽型叶柄表面产生圆球形小突起——球茎芽，一端出芽一端出根遗传性较稳定，球茎芽可直接放入土中种植观叶海棠球茎芽型

叶柄表面产生圆球形小突起——球茎芽，一端出芽一端出根遗传性较稳定，球茎芽可直接放入土中种植唐菖蒲观叶海棠第十二页，共六十八页，编辑于2023年，星期日块茎型叶片或叶柄上形成粒状芋块，进一步分化出芽和根块茎芽可为繁殖系母体，不断切割繁殖移栽，成活率高。花叶芋

第十三页，共六十八页，编辑于2023年，星期日鳞茎型鳞片近轴面或边缘直接形成带根的小鳞茎在试管内形成小鳞茎需较长时间百合 郁金香第十四页，共六十八页，编辑于2023年，星期日孢子型

用成熟或未成熟的孢子进行培养孢子繁殖最困难的是表面消毒，萌发时间较长地钱狼尾蕨第十五页，共六十八页，编辑于2023年，星期日根茎型

蕨类具有横向的茎及直立的短根茎，为组织培养的最佳外植体根状茎上产生蕨叶及根，繁殖速度较孢子型快肾蕨等第十六页，共六十八页，编辑于2023年，星期日微枝扦插型

带芽的小插条在试管内进行无菌扦插为木本植物进行快速繁殖的主要方式葡萄、杨树第十七页，共六十八页，编辑于2023年，星期日3.1.3培养基3.1.3.1无机盐无机盐培养基的组成大量元素(使用浓度大于0.5mmol/L)微量元素(使用浓度小于0.5mmol/L)第十八页，共六十八页，编辑于2023年，星期日3.1.3.1无机盐第十九页，共六十八页，编辑于2023年，星期日3.1.3.2有机物氨基酸类重要的有机氮源维生素类以辅酶形式参与植物细胞代谢活动，对生长、分化具有很好的促进作用vb1，vb6糖类主要的碳源—蔗糖？天然有机添加物类CM（椰乳）、马铃薯汁、酵母提取液（YE）、番茄汁等第二十页，共六十八页，编辑于2023年，星期日蔗糖浓度分别为0、1%、5%第二十一页，共六十八页，编辑于2023年，星期日3.1.3.3调节物质（一）生长素类促进细胞伸长生长和分裂、诱导愈伤组织形成、促进生根，与一定量的细胞分裂素配合可诱导不定芽的分化、侧芽的萌发与生长、胚状体的产生等。常用的有2,4-D、NAA、IBA、IAAIAA为天然植物生长素，见光易分解，高温高压易受破坏；2,4-D有抑制芽形成的作用，一般用于细胞启动脱分化阶段；诱导分化则用NAA、NBA或IAA。IBA诱导生根效果最好。第二十二页，共六十八页，编辑于2023年，星期日（二）细胞分裂素类

促进细胞分裂、诱导愈伤组织或器官分化不定芽、解除顶端优势而促进侧芽增殖、抑制离体组织或器官衰老。 常用的有6-BA、KT、ZT6-BA第二十三页，共六十八页，编辑于2023年，星期日BA分别为0,0.1,5mg/LNAA分别为0,0.1,5mg/L第二十四页，共六十八页，编辑于2023年，星期日（三）赤霉素类

主要应用GA3，促进体细胞胚发育成小植株，GA3不耐热，水溶解后不稳定，应采用过滤除菌，并用酒精溶解。脱落酸

抑制蛋白质合成，抵消和抑制上述三种激素发挥作用；诱导休眠、促进衰老和脱落。乙烯第二十五页，共六十八页，编辑于2023年，星期日3.1.3.4植物细胞工程培养基配制培养基母液的配制大量元素一般配成10倍浓度的母液；微量元素和有机营养常配成100倍浓度的母液；混合定容时，注意药剂的添加顺序及稀释度，以免沉淀；生长调节类物质不溶于水,需用不同溶剂进行溶解单独配制的试剂：铁盐与EDTACaCl2

前P28第二十六页，共六十八页，编辑于2023年，星期日以KNO3为例1L培养基需要量为19g。在配制母液时，增加10倍量，为190g。在母液中的浓度为190g/L，即0.19g/ml在配制培养基时，取10ml，10ml×0.19g/ml=19g回P26第二十七页，共六十八页，编辑于2023年，星期日3.1.3.4植物细胞工程培养基配制培养基配制过程药品按顺序混合pH调整加热溶解器皿水洗干燥分装培养基加塞

冷却高压蒸汽灭菌

第二十八页，共六十八页，编辑于2023年，星期日3.1.3.5常用培养基到目前研制开发了数十种适宜不同植物、不同组织、不同细胞生长发育的培养基配方。但多数培养基配方是在几种普遍应用的培养基上演变而来的。这几种常见的培养基为是：MS、ER、B5、N6、NT、White等，其配方如下：第二十九页，共六十八页，编辑于2023年，星期日第三十页，共六十八页，编辑于2023年，星期日培养基分类根据培养基无机盐含量的差异将其分为以下4类：①高无机盐含量培养基（植物器官、花药、细胞及原生质体培养）；-MS②较高硝酸盐含量培养基（木本、十字花科和单子叶植物的组织和花药培养）；-B5③中等无机盐含量培养基（花药培养）；-H④低无机盐含量培养基（生根）。-WHITE第三十一页，共六十八页，编辑于2023年，星期日3.1.4植物组织培养问题分析3.1.4.1试管苗玻璃化现象（vitrification）是指组织培养过程中的特有的一种生理失调或生理病变，试管苗呈半透明状外观形态异常的现象。

玻璃化苗绝大多数为来自茎尖或茎段培养物的不定芽。通常玻璃化苗恢复正常的比例很低，在继代培养中仍然形成玻璃化苗。第三十二页，共六十八页，编辑于2023年，星期日玻璃化的解决方法增加培养基中的溶质水平，以降低培养基的水势；减少培养基中NH4+浓度；增加光照；增加容器通风，最好进行CO2施肥，这对减轻试管苗玻璃化的现象有明显的作用；降低培养温度，进行变温培养，有助于减轻试管苗玻璃化的现象发生；降低培养基中细胞分裂素含量，可以考虑加入适量脱落酸。第三十三页，共六十八页，编辑于2023年，星期日3.1.4.2褐变问题成因酶促----酚氧化成醌及聚合非酶促----醌聚合时段初代培养继代培养第三十四页，共六十八页，编辑于2023年，星期日①选择合适的外植体一般来说，最好选择生长处于旺盛的外植体，这样可以使褐变现象明显减轻。②合适的培养条件无机盐成分、植物生长物质水平、适宜温度、及时继代培养均可以减轻材料的褐变现象。③使用抗氧化剂在培养基中，使用半胱氨酸、抗坏血酸等抗氧化剂能够较为有效地避免或减轻很多外植体的褐变现象。④材料预处理和细胞筛选⑤使用吸附剂0.1%-0.5%的活性炭、PVP对防止褐变也有较为明显的效果。⑥连续转移对容易褐变的材料可间隔12~24h的培养后，再转移到新的培养基上，这样经过连续处理7-l0d后，褐变现象便会得到控制或大为减轻。减轻褐变现象发生的方法第三十五页，共六十八页，编辑于2023年，星期日3.1.4.3微生物污染问题原因消毒不彻底外植体消毒问题培养基及器皿消毒问题环境消毒问题无菌操作不过关第三十六页，共六十八页，编辑于2023年，星期日外植体消毒问题外植体取材外植体(expant)是指用于离体培养的活的植物组织。来源：第三十七页，共六十八页，编辑于2023年，星期日外植体消毒问题外植体灭菌的过程：

流水冲洗10~20min

表面消毒

无菌水冲洗4~5次

沥水待用Flash第三十八页，共六十八页，编辑于2023年，星期日常用消毒剂消毒灭菌效果比较消毒剂使用浓度%去除的难易消毒时间min效果次氯酸钙次氯酸钠漂白粉溴水过氧化氢升汞酒精抗生素硝酸银9~102饱和溶液1~210~120.1~170~754~5(mg/L)1易易易易最易较难易中较难5~305~305~302~105~152~100.2~230~605~30很好很好很好很好好最好好较好好第三十九页，共六十八页，编辑于2023年，星期日容器容积（mL）121℃下所需的最少灭菌时间(min）20~5075250~500100015002000152025303540培养基及器皿消毒灭菌问题培养基高压蒸汽灭菌所需的最少时间第四十页，共六十八页，编辑于2023年，星期日培养基灭菌培养基组成中若含有遇热易分解物质，如生长调节物质、维生素、尿素、酶等，则必须用过滤法除菌。过滤除菌时，使用孔径为0.22~0.45μm或更小的细菌滤膜。过滤除菌可利用抽滤装置或注射过滤器进行，所用器皿均应经过高压消毒灭菌，灭菌温度不超过121℃。第四十一页，共六十八页，编辑于2023年，星期日器皿消毒灭菌手术刀镊子平皿干热灭菌150-160℃，2h第四十二页，共六十八页，编辑于2023年，星期日环境消毒问题第四十三页，共六十八页，编辑于2023年，星期日无菌操作问题

评价下列操作正确与否第四十四页，共六十八页，编辑于2023年，星期日评价下列操作正确与否第四十五页，共六十八页，编辑于2023年，星期日评价下列操作正确与否第四十六页，共六十八页，编辑于2023年，星期日评价下列操作正确与否第四十七页，共六十八页，编辑于2023年，星期日无菌操作无菌操作前的准备工作无菌操作台的使用操作所用器械应浸泡在95%酒精中，用前需放在耐热器皿中加入少量酒精后进行灼烧，每次使用后都要灭菌。无菌操作步骤外植体的适当切割的注意事项继代培养的材料(液体材料、固体材料）第四十八页，共六十八页，编辑于2023年，星期日3.1.4.4其他问题培养条件控制激素水平光照：时间，强度和光质。温度：适温有利于细胞分裂与分化，而在一定范围内降低培养温度可以使细胞的质量增加；培养基昼夜变温可能有利于器官的发生。pH通常使用的pH值的范围是5.5－6.5。pH<4或>7，培养物不能正常生长。气体第四十九页，共六十八页，编辑于2023年，星期日激素水平的控制生长素应用的浓度范围为0.1~15mg/L。在细胞脱分化过程中，启动细胞分裂形成愈伤组织，以2,4-D最为有效。细胞脱分化需要高浓度的2,4-D，当胚性细胞形成转入再分化时，则需较低的2,4-D浓度。使用浓度范围为0.1~10mg/L。细胞分裂素既可诱导细胞分裂，又可调节细胞分化。第五十页，共六十八页，编辑于2023年，星期日16h/d24h/d0h/d光照时间的影响第五十一页，共六十八页，编辑于2023年，星期日液体振荡培养的愈伤组织生长与振荡频率的关系第五十二页，共六十八页，编辑于2023年，星期日3.2植物胚胎培养Flash第五十三页，共六十八页，编辑于2023年，星期日概念花药培养属于器官培养范畴花粉培养属于细胞培养范畴也称小孢子培养花药及花粉培养把发育到一定阶段的花药接种在人工培养基上，使其发育和分化成植株的过程从花药中分离出花粉粒使之成为分散或游离的状态，通过培养使其脱分化并发育成植株的过程第五十四页，共六十八页，编辑于2023年，星期日获得单倍体植株花药培养的基本程序：Flash选处于生殖生长高峰期的花药，需低温预处理（3～10℃，2～10天），光照先弱后强。花药培养目的及程序第五十五页，共六十八页，编辑于2023年，星期日花粉或小孢子的分离花粉或小孢子培养目的及方法目的：获得单倍体植株第五十六页，共六十八页，编辑于2023年，星期日花药看护培养花粉悬浮培养固液双层培养花粉培养方法第五十七页，共六十八页，编辑于2023年，星期日第五十八页，共六十八页，编辑于2023年，星期日3.3毛状根培养定义：毛状根(hairyroots)是（双子叶）植株或组织、器官经发根农杆菌（Agrobacteriumrhizogenes）感染后，形成的类似头发一样的根组织。又称发状根。

1934年，Hildebrand

报道了发根农杆菌感染苹果树产生发根。第五十九页，共六十八页，编辑于2023年，星期日毛状根的特性特性：毛状根可以不依赖激素快速生长，根多丛生，多分枝，多根毛，无向地性。生理生化和遗传稳定。为什么可以不依赖激素？发根农杆菌的Ri质粒上的T-DNA片断整合进植物细胞核基因组中。T-DNA上有生长素合成基因tms1和tms2能够指导IAA的合成。第六十页，共六十八页，编辑于2023年，星期日3.3.1毛状根的诱导3.3.1.1外植体接种法---共培养3.3.1.2茎秆接种法3.3.1.3原生质体-农杆菌共培养法第六十一页，共六十八页，编辑于2023年，星期日生物反应器培养青蒿毛状根生产青蒿素青蒿：为双子叶植物药菊科植物青蒿素：倍半萜内酯类化合物功效：治疗疟疾第六十二页，共六十八页，编辑于2023年，星期日1.Bioreactor,2.Concentricdraughtcylinder,3.Stainlessstellmesh,4.Airou