分光光计的使用

分光光度计的使用当前第1页\共有18页\编于星期五\17点主要内容１、分光光度法的概念２、分光光度计的结构与原理３、分光光度计的使用４、实验操作（CuSO4溶液标准曲线的绘制）当前第2页\共有18页\编于星期五\17点分光光度法的概念分光光度法：是利用物质特有的吸收光谱，进行物质鉴定及测定其含量的一种分析技术。也称为吸收光谱法。是光谱分析技术中最常见的一种，应用最多的是紫外及可见分光光度法。特点：灵敏、精确、快速和简便。应用：生物化学微量物质定量分析测定研究中广泛使用的方法之一，常用于糖，蛋白质，核酸，酶等的快速定量检测。光谱范围：200～1000nm。当前第3页\共有18页\编于星期五\17点分光光度法的概念红外分光光度计:大于760nm的红外光区可见光分光光度计:400～760nm的可见光区紫外分光光度计:

200～400nm的紫外光区分光光度计的分类当前第4页\共有18页\编于星期五\17点722E可见分光光度计当前第5页\共有18页\编于星期五\17点722E可见分光光度计当前第6页\共有18页\编于星期五\17点分光光度计的基本结构光源单色光器吸收池检测系统钨丝灯氢灯氘灯棱镜衍射光栅玻璃比色杯石英比色杯硒光电池光电管光电倍增管当前第7页\共有18页\编于星期五\17点当前第8页\共有18页\编于星期五\17点当一束单色光透过溶液时部分被吸收部分被反射部分被透过IrIaI入射光

I0出射光I比色皿吸收杯反射光

IrIa吸收光分光光度计基本原理当前第9页\共有18页\编于星期五\17点Ｉ/I0表示光线透过溶液的程度,称为透光度,用T表示；－IgT表示溶液对光线的吸收程度，用吸光度（A）表示。即I0CIA＝－IgT＝－IgII0←L→

当前第10页\共有18页\编于星期五\17点Lambert-Beer定律（光吸收定律）Lambert定律：A＝K1LBeer定律：A＝K2C

Lambert-Beer定律：当一束单色光垂直通过一均匀的溶液时，溶液的吸光度A，与溶液的浓度C及溶液的厚度L成正比。即A＝KCL其中：A－吸光度K－为消光常数，表示物质对光线吸收的能力，受物质种类和光线波长的影响C－溶液的浓度L－溶液的厚度当前第11页\共有18页\编于星期五\17点当前第12页\共有18页\编于星期五\17点Lambert-Beer定律的应用1、利用标准管计算测定物的含量用一已知浓度标准溶液和一个未知浓度的待测溶液同样处理显色，测定吸光度，根据Lambert-Beer定律得：A1=K1C1L1A2=K2C2L2

因为K1=K2L1=L2

所以C2=A2A1×C1当前第13页\共有18页\编于星期五\17点Lambert-Beer定律的应用2、利用标准曲线计算测定物含量先配制一系列已知浓度的测定物溶液，按要求方法处理显色，在最大吸收波长（λmax）处读取各管的吸光度，以各管吸光度A为纵坐标，对应浓度C为横坐标，作标准曲线。以后进行测定时，待测样品以相同条件在λmax处读取吸光度，从标准曲线上即可查得该待样品的浓度。

当前第14页\共有18页\编于星期五\17点吸光度A蛋白质浓度（μg/ml）蛋白质标准曲线（双缩脲法：λ＝540nm）0.20.40.6....40801201600当前第15页\共有18页\编于星期五\17点722E分光光度计使用基本操作：（示教）

通电→仪器自检（BLA）→预热20min→设定波长→方式设定（MOOD→T（或A）

→仪器调“0.000”(将遮光杯）置入光路，在T方式下按“%T”键，→仪器自动校正后显示“0.000→参比液调“0.000”A

→样品测定→读取“A”。

当前第16页\共有18页\编于星期五\17点722E分光光度计使用注意事项：1、预热----保证仪器准确稳定；2、比色皿的清洁----待测液润洗、冲洗；3、比色皿配套----比色皿不能随意；4、比色皿内盛液体量----2/3，有液体，应用擦镜纸拭干，以保证光路通过时不受影响；5、拿放比色皿----应持其“毛面”，杜绝接触光路通过的“光面”；6、溶液浓度要适当：吸光度读数处于0.1～0.7范围内为宜，否则误差较大，要适当调整浓度。7、分光光度计连续使用一般不超过2h。

当前第17页\共有18页\编于星期五\17点实验操作实验内容：CuSO4溶液标准曲线的绘制操作步骤：1、用30%CuSO4溶液配制10%、15%、20%、25%、30%的CuSO