基因工程操作步骤

基因工程操作步骤当前第1页\共有44页\编于星期五\7点知识回顾：基因工程基本操作的四个步骤1、目的基因的获取2、基因表达载体的构建3、目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用

载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。

才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。当前第2页\共有44页\编于星期五\7点一、目的基因的获取1目的基因主要是编码蛋白质的基因：如：与生物抗性相关的基因、与优良品质相关的基因、与生物药物和保健品相关的基因、与毒物降解相关的基因、与工业用酶相关的基因、具调控作用的因子等。2获取目的基因的常用方法：1、从基因文库中获取2、利用PCR技术扩增3、人工合成当前第3页\共有44页\编于星期五\7点原核细胞的基因结构非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游与RNA聚合酶结合位点启动子终止子①不编码蛋白质。：编码蛋白质,连续不间断编码区非编码区②调控遗传信息表达,上游有RNA聚合酶结合位点:基因结构当前第4页\共有44页\编于星期五\7点真核细胞的基因结构编码区非编码区非编码区内含子外显子启动子终止子编码区上游编码区下游编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列：有调控作用,上游有RNA聚合酶结合位点(启动子)。与RNA聚合酶结合位点基因结构当前第5页\共有44页\编于星期五\7点1.从基因文库中获取目的基因1.基因文库的概念:将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因。2.基因文库的种类:基因组文库：含有一种生物的全部基因部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，如：cDNA文库当前第6页\共有44页\编于星期五\7点基因组DNA文库与cDNA文库某生物体内全部DNA

许多DNA片段受体菌群体限制酶与运载体连接导入基因组文库cDNA反转录受体菌群体与运载体连接导入cDNA文库某种生物某个时期的mRNA当前第7页\共有44页\编于星期五\7点真核细胞的cDNA的获取编码区非编码区非编码区DNA聚合酶剪接有关的酶RNA聚合酶mRNA前体mRNA单链DNAcDNA逆转录酶转录剪接逆转录复制启动子终止子基因不含非编码序列。即不含非编码区和内含子当前第8页\共有44页\编于星期五\7点基因组DNA文库与cDNA文库的比较小大无有无有某种生物的部分基因某种生物的全部基因可以部分基因可以当前第9页\共有44页\编于星期五\7点③怎样从基因文库中找到我们所需要的目的基因根据目的基因的有关信息，例如，根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA，以及基因的表达产物蛋白质等特性来获取目的基因。当前第10页\共有44页\编于星期五\7点2.利用PCR技术扩增目的基因1概念：PCR全称为_______________，是一项在生物____复制___________的核酸合成技术。2原理：DNA复制原料：模板DNA；DNA引物；四种脱氧核苷酸；热稳定DNA聚合酶多聚酶链式反应体外特定DNA片段3前提：已知目的基因的一段核苷酸序列当前第11页\共有44页\编于星期五\7点PCR技术的操作过程a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板在热作用下，_____断裂，形成________b、退火（复性55℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，合成与模板互补的________。氢键单链DNA双链DNA链d.重复步骤：每重复一次，目的基因增加___倍一当前第12页\共有44页\编于星期五\7点5/3/G—GT—C3/5/G—AC—C5/3/引物ⅡG—G变性复性延伸1.目的基因DNA受热变性，解链；2.引物与单链互补结合；3.合成链在DNA聚合酶作用下进行延伸。5/3/A—G引物Ⅰ当前第13页\共有44页\编于星期五\7点③过程：当前第14页\共有44页\编于星期五\7点PCR技术的操作过程PCR反应体系中目的基因成指数(2n)形式扩增当前第15页\共有44页\编于星期五\7点PCR技术扩增与DNA复制的比较碱基互补配对原则碱基互补配对原则四种脱氧核苷酸、模板、酶、ATP四种脱氧核苷酸、模板、酶、引物DNA在高温下变性解旋解旋酶催化解旋半保留复制、边解旋变复制半保留复制、全解旋再复制体外复制主要在细胞核内大量的DNA片段形成整个DNA分子热稳定的DNA聚合酶细胞内的DNA聚合酶、解旋酶、DNA连接酶等当前第16页\共有44页\编于星期五\7点PCR技术扩增过程a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板在热作用下，

断裂，形成_______

b、复性（55℃-60℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的________。氢键单链DNA双链DNA链当前第17页\共有44页\编于星期五\7点3.人工合成法

在基因较小，核苷酸序列已知的情况下，可以利用DNA合成仪人工合成蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列基因的核苷酸序列目的基因化学合成推测推测思考：化学法合成的目的基因含内含子、启动子和终止子吗？当前第18页\共有44页\编于星期五\7点人工合成法（真核生物）反转录法目的基因的信使RNA目的基因化学合成法肽链氨基酸序列信使RNA序列基因的核苷酸序列目的基因合成推测推测单链DNA合成当前第19页\共有44页\编于星期五\7点课堂小结目的基因的获取1、从基因文库中获取2、利用PCR技术扩增3、人工合成种类基因组文库：含有一种生物的全部基因部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，如：cDNA文库当前第20页\共有44页\编于星期五\7点二、基因表达载体的构建——基因工程的核心1目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。2基因表达载体的组成：复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因当前第21页\共有44页\编于星期五\7点二、基因表达载体的构建——核心（1）用一定的_________切割质粒，使其出现一个切口，露出____________。（2）用___________切断目的基因，使其产生_________________。（3）将切下的目的基因片段插入质粒的______处，再加入适量___________，形成了一个重组

DNA分子（重组质粒）限制酶黏性末端同一种限制酶的黏性末端切口DNA连接酶相同1.过程:当前第22页\共有44页\编于星期五\7点基因表达载体的构建——核心质粒DNA分子一个切口两个黏性末端两个切口获得目的基因DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）同一种限制酶

目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程。表达载体过程:当前第23页\共有44页\编于星期五\7点基因表达载体的构建——基因工程的核心

1、目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。当前第24页\共有44页\编于星期五\7点2、基因表达载体的组成：复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因它们各自的作用是什么?当前第25页\共有44页\编于星期五\7点启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来当前第26页\共有44页\编于星期五\7点3.基因表达载体的组成：它们有什么作用？a、目的基因b、启动子c、终止子d、标记基因位于基因的首端,是mRNA结合位点位于基因的末端,终止转录检测目的基因是否导入受体细胞当前第27页\共有44页\编于星期五\7点三、将目的基因导入受体细胞1转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。2常用的受体细胞：大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。3目的基因导入受体细胞的原理：借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。当前第28页\共有44页\编于星期五\7点1、目的基因导入植物细胞的方法（1）农杆菌转化法①农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力。②原理：Ti质粒上的T---DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。当前第29页\共有44页\编于星期五\7点三、目的基因导入受体细胞构建基因表达载体转入农杆菌植物细胞导入稳定维持和表达③过程：当前第30页\共有44页\编于星期五\7点1、目的基因导入植物细胞的方法（2）基因枪法：目的基因导入单子叶植物细胞①操作方法：利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。②

钨粉粒子和金粉粒子，粒子的直径一般在0.6～4um。③适用：单子叶植物当前第31页\共有44页\编于星期五\7点1、目的基因导入植物细胞的方法（3）花粉管通道法：将目的基因导入植物细胞①操作方法：在植物花受粉后，花粉形成花粉管还末愈合前期，剪去柱头，然后，滴入DNA（含的基因）使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞②

特点:十分简便经济。③例：转基因抗虫棉当前第32页\共有44页\编于星期五\7点2、将目的基因导入动物细胞①方法：显微注射法①程序目的基因表达载体提纯取卵（受精卵）显微注射受精卵新性状动物当前第33页\共有44页\编于星期五\7点3、将目的基因导入微生物细胞①微生物作受体细胞原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少②常用菌：大肠杆菌③常用法：Ca2+处理获得感受态细胞④过程：Ca2+处理大肠杆菌感受态

细胞感受态细胞吸收DNA表达载体与感受态细胞混合当前第34页\共有44页\编于星期五\7点小结：将目的基因导入受体细胞当前第35页\共有44页\编于星期五\7点四、目的基因的检测与鉴定导入过程完成后，全部受体细胞都能摄入重组DNA分子吗？1真正能摄入重组DNA分子的受体细胞很少。2目的基因进入受体细胞后，是否都能稳定维持和表达？不一定，需要检测当前第36页\共有44页\编于星期五\7点1、鉴定——分子水平的鉴定转基因生物的DNA探针15N15N14N14N（1）检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因基因探针：放射性同位素等标记的DNA分子方法——DNA分子杂交技术变性变性当前第37页\共有44页\编于星期五\7点1、鉴定——分子水平的鉴定变性方法——分子杂交技术（2）检测目的基因是否转录出了mRNA探针15N15N转基因生物的mRNA14N14N当前第38页\共有44页\编于星期五\7点1、鉴定——分子水平的鉴定提取（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质方法——抗原-抗体杂交苏云金杆菌Bt毒素蛋白将Bt毒蛋白注射小鼠体内从小鼠血管抽出血液分离出抗Bt毒素的抗体抗体蛋白质

出现杂交带脱分化组织培养当前第39页\共有44页\编于星期五\7点2、鉴定——个体水平的鉴定抗虫、抗病接种实验，活性比较实验例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入