细菌病毒培养技术详解演示文稿

细菌病毒培养技术详解演示文稿当前第1页\共有47页\编于星期四\7点（优选）细菌病毒培养技术当前第2页\共有47页\编于星期四\7点当前第3页\共有47页\编于星期四\7点（二）细菌生长繁殖的方式二分裂法繁殖方式：链球菌八叠球菌葡萄球菌当前第4页\共有47页\编于星期四\7点（三）细菌生长繁殖的速度当前第5页\共有47页\编于星期四\7点（四）细菌生长繁殖的速度分为四期：迟缓期、对数期、稳定期、衰退期当前第6页\共有47页\编于星期四\7点（五）常用培养基种类厌氧培养基基础培养基增菌培养基选择培养基鉴别培养基当前第7页\共有47页\编于星期四\7点细菌培养技术

1细菌的培养基本知识2细菌的规模化培养3细菌的计数技术当前第8页\共有47页\编于星期四\7点二、细菌的规模化培养种子接种

是指菌体增殖培养物。收获时间

最佳培养时间依据细菌的生长曲线而定。对数生长期当前第9页\共有47页\编于星期四\7点培养方法1．固体培养基表面培养法

用于制备抗原、灭活苗、冻干苗。2．液体静置培养法

需氧菌（深度1/2）和兼性厌氧均可用，厌氧菌（深度3/4），还需加肝块。3．深层通气培养法

是目前菌苗生产的主要培养法。安装有自动控温、消泡、调pH、自动控制通气量、自动磁力搅拌等装置。细菌接种1～2h，再通入滤过除菌空气，并适当搅拌分散通入的气体，以增加培养液中的溶氧量。及时补充营养。当前第10页\共有47页\编于星期四\7点4．透析培养法在细菌培养液与培养基之间隔有一层透析膜，使培养基中高浓度小分子量的营养成分通过透析膜（不能透过大分子的细菌或毒素）不断扩散到细菌培养液中，供细菌生长繁殖，获得高浓度的细菌或毒素。透析器1.螺栓2.培养基贮存室3.视镜4.透析膜5.培养室当前第11页\共有47页\编于星期四\7点5、连续培养

连续培养系统是一个恒定体积的流动系统，新鲜培养基以恒定的速度流入，又以相同的速率流出除去多余的液体，细菌始终保持在对数生长期。当前第12页\共有47页\编于星期四\7点细菌培养技术

1细菌的培养基本知识2细菌的规模化培养3细菌的计数技术当前第13页\共有47页\编于星期四\7点三细菌的计数技术细菌性疫苗在制造中，往往需要计算每毫升所含细菌的总数。

1.显微镜直接计数法2.活菌计数法倾注平板培养法将被测样品根据菌数含量多少，用普通肉汤或生理盐水作10倍递进稀释。分别取其1ml加在灭菌的平皿中，然后取预先加热融化且冷至45～50℃，立即摇匀放平，凝固后培养，统计平皿上长出的菌落数，乘以稀释倍数，即为每毫升样品中含有的活菌数。当前第14页\共有47页\编于星期四\7点平板表面散布法

接种量为0.1ml琼脂板的制备稀释菌液接种培养计数选择菌落数在30～300之间的平皿用以计数，每个稀释度应取其菌落平均数。

活菌数／ml=2个平板平均菌落数×10×稀释倍数。举例：在10稀释的平板中所得平均菌落数为78个。计算结果：78×10×10

=7.8×10个活菌／ml微量点板计数法

接种量为0.02ml10-8-8当前第15页\共有47页\编于星期四\7点

3比浊计数法

是对比细菌悬液与标准管的浊度，求出大致的菌数。原理：菌液中含数多少与其浑浊度成正比。方法：比浊管比浊法和分光光度计法。优点：快速简便应用：常用于菌苗及其他生物制剂的生产、细菌毒力的测定和攻毒量的确定等。当前第16页\共有47页\编于星期四\7点标准比浊法比浊管由国家生物制品检定部门提供，每套包括一支细菌比浊标准管、数支对照空管和一张比浊用的图片。比浊方法将空管拭刷干净，加入待测菌液1ml。将标准管与待测管并列紧贴在图片前，使两管受光均匀，然后透过两管管壁对比观察，目测图片的清晰度，并将两管左右换位，反复对比。例如：测定大肠杆菌的菌数，若1ml菌液加入4ml的生理盐水后，与标准管的浊度相同，即表示该菌液经5倍稀释后相当于标准管。大肠杆菌标准管的菌数相当于8亿个／ml，故被测菌数为8×5=40亿个／ml。当前第17页\共有47页\编于星期四\7点分光光度计法借助于分光光度计。在一定波长下测定菌液的光密度值注意：测量时一定要控制菌浓度与光密度成正比的线性范围内，否则不准确。当前第18页\共有47页\编于星期四\7点病毒培养技术

1病毒的复制2病毒的动物培养技术3病毒的禽胚培养技术4病毒的细胞培养技术当前第19页\共有47页\编于星期四\7点

病毒复制：以病毒基因为模板，在酶的作用下，分别合成基因和蛋白质，再组装成完整的蛋白颗粒，这种方式称为复制（replication)。当前第20页\共有47页\编于星期四\7点吸附侵入早期：病毒特异性酶的合成病毒核酸复制病毒结构蛋白质合成装配释放病毒大分子合成当前第21页\共有47页\编于星期四\7点病毒培养技术

1病毒的复制2病毒的动物培养技术3病毒的禽胚培养技术4病毒的细胞培养技术当前第22页\共有47页\编于星期四\7点1病毒的动物培养技术动物的选择应当选择SPF动物。选择动物的条件下：①选用对病毒易感性高。②动物健康、体重、年龄尽可能一致，符合培养病毒要求。③遗传特性相似，实验结果具有一致性、准确性和可比性。④外购动物要了解当地动物群健康，饲养及免疫接种情况，接前要经过健康观察，以免误用带有病原体动物。当前第23页\共有47页\编于星期四\7点1.皮内接种2.皮下接种3.肌肉接种4.静脉接种5.腹腔接种动物接种途径和方法当前第24页\共有47页\编于星期四\7点动物接种后的饲养管理与收获病毒

1.接种病毒后的动物,每天观察和检查规定的各项指标，主要有精神、食欲、粪便、尿液、被毛状态、活动情况和接种部位的局部反应，每天测体温1次，做好记录。2.出现反应症候动物，按规定方法剖杀，采取含病毒高的组织脏器。当前第25页\共有47页\编于星期四\7点病毒培养技术

1病毒的复制2病毒的动物培养技术3病毒的禽胚培养技术4病毒的细胞培养技术当前第26页\共有47页\编于星期四\7点2病毒的禽胚培养技术工序过程：如何完成此项任务？选择禽胚前孵育接种后孵育收获病毒当前第27页\共有47页\编于星期四\7点操作要点1禽胚的选择理想的禽胚是SPF鸡胚，常以非免疫鸡胚补充。2禽胚的接种前孵育孵化前消毒，温度37.5～38.5℃，相对湿度50%～60%，定时翻蛋，保证通风。孵化4～5d照蛋检查，淘汰无精蛋和死胚，孵化至所培养病毒需要的日龄即可接种。

当前第28页\共有47页\编于星期四\7点3禽胚的接种途径痘病毒和疱疹病毒，10～13日龄

流感、新城疫、传支等，9～11日龄鹦鹉热衣原体和立克次氏体等，6～8日龄正粘病毒和副粘病毒，10～11日龄当前第29页\共有47页\编于星期四\7点4禽胚的接种后孵育

接种后，蜡泪封孔，置37℃下孵化，每天照蛋2次以上，通过禽胚的病变初步确定病毒的存在及增殖情况，淘汰24h内死胚。操作要点病毒感染指征：死亡充血、出血或出现坏死灶畸形出现痘斑当前第30页\共有47页\编于星期四\7点5病毒的收获

操作要点绒毛尿囊膜接种尿囊膜接种卵黄囊接种羊膜腔接种当前第31页\共有47页\编于星期四\7点照蛋任务实例—病毒的尿囊腔接种培养技术当前第32页\共有47页\编于星期四\7点尿囊腔接种法当前第33页\共有47页\编于星期四\7点接种部位消毒任务实例—病毒的尿囊腔接种培养技术当前第34页\共有47页\编于星期四\7点尿囊腔接种任务实例—病毒的尿囊腔接种培养技术当前第35页\共有47页\编于星期四\7点当前第36页\共有47页\编于星期四\7点收获尿囊液—每枚鸡胚收获尿囊液6～8ml任务实例—病毒的尿囊腔接种培养技术当前第37页\共有47页\编于星期四\7点当前第38页\共有47页\编于星期四\7点病毒培养技术

1病毒的复制2病毒的动物培养技术3病毒的禽胚培养技术4病毒的细胞培养技术当前第39页\共有47页\编于星期四\7点细胞培养技术（cellculture)

细胞培养技术是选用各种细胞的最佳生存条件对活细胞进行培养和研究的技术。即：利用机械、酶或化学方法使活体动物组织或传代细胞分散成单个乃至2～4个细胞团悬液的培养，使之能继续生存、生长、增殖的一种方法。广义上:还包括组织培养、器官培养。当前第40页\共有47页\编于星期四\7点3病毒的细胞培养技术细胞培养的方式原代培养：从直接取自生物体细胞、组织或器官开始的培养。

次代培养：将原代细胞培养物轻微消化后，再洗下分装至含新鲜培养液的培养管中继续培养。传代培养：将培养细胞以一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶中进行培养。

当前第41页\共有47页\编于星期四\7点培养常用的细胞上皮细胞、成纤维细胞根据培养细胞的染色体和繁殖特性，可分为：⑴原代细胞直接利用新鲜动物组织经胰蛋白酶消化、分散，获得单个细胞，如鸡胚成纤维细胞，此细胞对病毒的检测最为敏感，但制备和应用不方便。

⑵二倍体细胞（细胞株）由原代细胞或次代细胞选育出具有特殊生物学性质和标记的细胞，如猪肾细胞株（PK-15）和乳仓鼠肾细胞株（BHK-21）等。适用于病毒性生物制品的制备，常用于疫苗生产，安全可靠。

⑶传代细胞（非二倍体细胞系、异倍体细胞）指不再保持原来细胞的二倍体细胞数，在体外可以无限传代的细胞，如人子宫癌细胞（HeLa细胞）和鼠肾腺癌细胞（RAG细胞）等。有致癌性，不能用于疫苗生产，多用于病毒的分离鉴定。

当前第42页\共有47页\编于星期四\7点1.培养液：生长液、维持液，Eagle氏液、RPMI-1640、199、DMEM、MEM等营养液

。2.细胞接种量:适宜。3.pH：一般为7.0～7.4因细胞种类不同而略有差异。4.温度：一般为37～38℃。5.气体：氧气和二氧化碳。6.无菌条件：培养的全过程都要求严格的无菌条件。细胞培养的基本条件当前第43页\共有47页\编于星期四\7点各种组织是靠细胞间质黏合而成的，要获得分散的细胞，必须破坏细胞间质。分散细胞的方法的三种：机械分散法：适用于细胞间连接较松的组织，如禽胚组织。

酶消化法：此法适用于原代细胞的制备及细胞的传代培养。螯合剂分散法：一般只用于单层细胞的分散。

分散细胞的方法当前第44页\共有47页\编于星期四\7点

1.单层细胞培养法

用胰酶将剪碎的组织或传代细胞分散成2～6个成团的细胞，接种到培养瓶或培养板上，让细胞贴壁生长，静置培养或转瓶生长培养。

2.悬浮细胞培养法（搅拌培养）

通过振荡或转动装置使细胞始终分散悬浮于培养液内的培养方法。3.微载体培养通过搅拌悬浮在培养液