实验二细菌培养与代谢产物检查

试验二细菌培育与代谢产物检查【目的】①学习并初步把握根底培育基制备方法。②了解细菌生长生殖所需要养分以及常用培育基的种类和用途。③了解细菌所具有的不同生化反响及代谢产物，以利细菌的鉴定和鉴别④标准地进展无菌操作。一、根底培育基的制备〔一〕培育基的制作程序培育基制作的一般程序：准确称量培育基的各种成分T混合溶解一测定及矫正pHH分装、包装f灭菌f检定f保存备用。〔二〕常用培育基的种类〔10.3%,氯化钠0.5％，用蒸馏水溶解〕〔1〕肉汤培育基。〔2〕普通琼脂2〜3%的琼脂，呈固体状。〔3〕半固体培育基，含〜0.5%的琼脂。养基中参与5%〜10%的脱纤维动物血〕。

〔在一般琼脂培③选择培育基：如SS菌。④鉴别培养基：如含铁双糖培育基，用以鉴定细菌。⑤厌氧培育基：如庖肉培育基，用以培育厌氧菌。〔三〕根底培育基的制备过程1、肉汤〔肉浸液〕培育基【材料】〔蒸馏水或自来水NaOH〔1N和N/10〕、0.02%酚红指示剂、吸管等。【方法】①取颖瘦牛肉，除去脂肪及筋膜，切成小块后用绞肉机绞碎，每 500g碎肉加水1000ml，混合置4C冰箱过夜〔使养分物质即溶解性蛋白质充分渗出〕。1小时。③用数层纱布过滤，弃去肉渣〔肉渣中的液体应尽量挤净〕，于滤液中参与1%蛋白胨及0.5%氯化钠，加热溶解，并补足失水至1000ml。④冷却到50T在右，以N/10NaOH调至pH7.6〜7.8。⑤待pH10min,使肉汤中局部蛋白质等因加碱及再度加热而凝固pH值一次，103.34kPa〔15磅〕20min高压灭菌后，置冰箱中或枯燥阴凉处备用。【用途】用作根底培育基，其养分比肉膏汤好，一般养分要求不高的细菌均可生长。2、肉膏汤培育基1000毫升能浓缩成肉膏约70克。牛肉膏汤〔如糖分〕其养分价值略低于牛肉汤。但肉膏汤制作手续简洁，制品透亮清楚，酸碱度变化较小，故仍常用。0.02管等。【方法】3〜5g10g5g1000ml水中，用玻棒搅拌使其溶解。必要时加热使其溶解。②矫正至pH7.4〜7.63〜5min,过滤。1520min，置冰箱中或枯燥阴凉处备用。【用3100C,40C,利用此特性，加至肉汤或肉膏汤内后，趁热可制得斜面，平板等不同类型的固体培育基，以供分别培育、生殖细菌等用。【材料】pH7.6牛肉汤或牛肉膏汤、琼脂、空试管、灭菌培育皿〔9cm直径〕。【方法】①于pH7.6的牛肉汤或牛肉膏汤中，参与2〜3％琼脂，加热溶化。〔或不过滤〕，分装烧瓶或试管〔5m1〕。③经15磅20min高压灭菌后，趁热将装有5ml肉汤琼脂之试管斜置，待冷凝后即成琼脂斜面培育基。高层琼脂的分装量约为试管长度的 1／4或1／3；假设2/350〜60C时，以无菌操作法将其倾入灭菌空培育皿中〔15〜20ml〕，快速盖上皿盖，并将培育皿于桌面轻轻回转摇动，使皿内培育基平铺皿底，待冷凝后即成琼脂平板培育基。【用途】①琼脂斜面培育基用于纯种细菌接种以保存一般菌种。②琼脂平板培育基用于细菌的分别培育。4、肉汤琼脂半固体培育基【材料】pH7.6的牛肉汤或牛肉膏汤、琼脂、空小试管〔10x100mm〕【方法】①于pH7.6的牛肉汤或牛肉膏汤中，参与0.3 0.5%琼脂，加热溶化后，过滤并补足失水。3ml1520min高压灭菌后直立冷凝即成。【用途】常用于细菌的动力检查和菌种保存。5、枯燥培育基枯燥培育基是将颖配制的液体培育基用喷雾、真空、低温、蒸发等枯燥方法，将培育基内水分去掉后形成各种固形成分，经过适当处理使成枯燥粉末状。用时只要按确定比例参与确定量的蒸馏水，经过溶解、分装、高压灭菌即可应用。其优点是节约时间、使用便利。二、细菌的接种法〔一〕分别培育法细菌种类多且分布广，因此临床标本如粪便、痰、脓等以及水、牛常含有多种细【材料】葡萄球菌和大肠埃希菌的混合菌液、一般琼脂平板。【方法】当标本中含有两种以上细菌时，可用平板划线接种法。划线方法很多，平板分别划线接种为常用的分别培育法，最终均使混杂的细菌在琼脂平板外表分散，形成菌苔；或者使单个细菌固定在一点上生长生殖，形成单个菌落而得到纯种细菌。操作方法：①右手持接种环，火焰灭菌后，挑取待分别标本一环；②左手持琼脂平板，以左手拇指和食指将平板盖开启，右手将沾有检材之接种环伸入平板，与平板培育基外表成45°角，如以下图，在培育基外表分区划线〔每区划线后，接种环都须经火焰灭菌〕，盖好平板。最终接种环火焰灭菌；③在平板底上标好〔标签纸写好后贴上37C温箱中培育，24小时后观看结果。【观看结果】

平板划线接种法观看琼脂平板培育基外表菌苔以及单个菌落生长状况，即观看琼脂平板培育基外表单个菌落的大小、外形、突起、边缘、菌落外表、潮湿度、透亮度及颜色等性状。挑取单个菌落可获得纯培育。〔二〕纯种细菌培育法各种检材经分别培育得纯种细菌后，假设需保存菌种或进一步测试其生化反响等生物学特性时，必需进展纯种细菌培育。依据常用培育基的物理性状，纯种细菌培育接种法有以下几种。1、琼脂斜面培育基接种法凡具有斜面外形的的固体培育基均承受此种方法接种细菌。【材料】琼脂斜面培养基、大肠埃希菌琼脂斜面18〜24小时培育物。【方法】①右手持接种环，火焰灭菌后，在琼脂板上挑取单个典型可疑菌落少许；内。

37°C24小时后观看。1/3处标好组别、姓名、日期等。琼脂斜面接种法【观看结果】观看斜面外表菌苔生长状况。2、半固体培育基接种法半固体琼脂培育基、醋酸铅培育基及明胶培育基等均用本法接种细菌。【材料】半固体琼脂培育基、痢疾志贺菌及大肠埃希菌斜面培育物。【方法】右手持接种针，火焰灭菌后，挑取菌落或菌苔少许，垂直刺入半固体培育基的中心，3/437C24小时后观看。【观看结果】观看细菌能否运动。有鞭毛菌能运动，细菌沿穿刺线集中生长，使培育基呈毛玻璃样混浊；而无鞭毛菌则不能运动，细菌沿穿刺线生长，其四周培育基仍为原来的透亮度。液体培育基、半固体培育基接种法3、液体培育基接种法【材料】肉汤、葡萄糖蛋白胨水及各种单糖发酵管等液体培育基都用本法接种细菌。材料为普18〜24小时培育物。【方法】①右手持接种环，火焰灭菌后，用接种环挑取菌落少许，如以下图，在接近培育基液面的管壁上轻磨后，竖直试管，使接种的细菌混入培育液 〔图9-3A〕②各种培育基接种细菌后，即放入37°C24小时，观看结果。【观看结果】细菌生长状况：均匀混浊、菌膜、沉淀。〔三〕细菌在培育基中生长现象1、细菌在液体培育基中生长现象，观看结果并填入以以下图。细菌在液体培育基中生长现象2

9-1o纟田菌在 区生长最多，形成 ，在 区生长最少，可见单个 o3、细菌在半固体培育基中生长现象，观看结果并填入图。为动力试验阳性，只沿穿刺线生长为阴性。细菌在半固体培育基中生长现象三、细菌分解代谢产物检查【原理】不同的生化特点。和鉴定细菌方面起着重要作用。〔一〕糖发酵试验【原理】各种细菌因含有发酵不同糖类的酶，因而分解各种糖〔醇〕类的力气各不相同。有些能分解糖〔醇〕产酸，使指示剂变色，有些能产酸产气，有些则不能分解。据此可鉴别细菌的种类。糖发酵管是将葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇或蔗糖等参与蛋白胨水培育基0.75%1%,并参与确定量的溴甲酚紫指示剂和1内液体为紫色。接种细菌经37C孵育，细菌分解糖后，假设产酸，则使培育基变色。其颜色由所加指示剂而定，如指示剂为溴甲酚紫，则由紫色〔碱性〕变成黄色〔酸性〕；而且倒置小管内消灭气泡，以

表示；假设不分【材料】葡萄糖发酵管〔乳糖〕、产碱杆菌、伤寒沙门菌及大肠埃希菌斜面培育物。【方法】37r孵箱中培育18〜24小时。产碱杆菌不分解葡萄糖〔－〕；伤寒杆菌分解该糖产酸不产气〔＋〕；大肠埃希菌则产酸产气〔®〕。〔二〕吲哚〔靛基质〕试验〔Indol试验〕【原理】某些细菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨水中的色氨酸生成吲哚〔靛基质〕，吲哚本〔〕哚，易被肉眼察见。【材料】18〜24试剂。【方法】分别接种大肠埃希菌及乙型副伤寒沙门菌于蛋白胨水培育基中。 37r孵育24〜48小时。【观看结果】0.5ml1min左右，在二层液面交界处如消灭一圈玫瑰红色，即为吲哚试验阳性，假设不消灭红色，则为吲哚试验阴性。〔三〕硫化氢试验【原理】某些细菌能分解培育基中的胱氨酸等含硫氨基酸，产生硫化氢，硫化氢遇铅盐〔或铁盐〕〔或硫化铁〕硫化氢不再被氧化。【材料】醋酸铅培育基、大肠埃希菌及变形杆菌18〜24小时琼脂斜