放射免疫荧光标记免疫详解

放射免疫荧光标记免疫详解演示文稿当前第1页\共有42页\编于星期三\5点优选放射免疫荧光标记免疫当前第2页\共有42页\编于星期三\5点免疫标记技术=抗原抗体反应示踪物标记灵敏度特异性免疫标记技术的主要特点：高特异性、高灵敏度免疫技术+标记技术当前第3页\共有42页\编于星期三\5点检测方法检测范围生化、常规免疫mg~μg（10-3~10-6g）荧光免疫、酶免疫μg~ng（10-6~10-9g）放射免疫、发光免疫ng~pg（10-9~10-12g）PCRpg~fg（10-12~10-15g）当前第4页\共有42页\编于星期三\5点标记技术：将可被探测的示踪物质用化学方法与化合物连接。免疫技术：以抗原-抗体反应原理为基础，对样品中相应抗原或抗体进行检测。标记免疫分析：是利用多种标记技术与免疫技术相结合而建立的测定技术体系。其核心即是高灵敏性和高度特异性的有机结合。标记免疫技术－基本概念当前第5页\共有42页\编于星期三\5点常见免疫标记技术放射免疫技术荧光免疫技术酶免疫技术

当前第6页\共有42页\编于星期三\5点放射免疫技术

当前第7页\共有42页\编于星期三\5点1959年，美国，Yalow和Berson测定血清胰岛素含量（标记抗原）1977年获诺贝尔医学奖

放射免疫分析技术

（Radioimmunoassay，RIA）

优点：特异性强，灵敏度高，结果准确，检样用量少，结果重复性好，操作易自动化；缺点：对抗体质量要求高，有放射性危害，检测仪器价格较高当前第8页\共有42页\编于星期三\5点放射免疫技术分类1.放射免疫分析(radioimmunoassay,RIA)

以标记抗原与反应系统中未标记抗原竞争结合特异性抗体来测定待检样品中抗原量。2.免疫放射分析(immunoradiometricassay,IRMA)

以过量标记抗体与抗原非竞争结合，采用固相免疫吸附载体分离游离和结合标记抗体。3.其他：

放射受体分析(radioreceptorassay,RRA)放射配体结合分析(radioligandbindingassay,RBA)当前第9页\共有42页\编于星期三\5点

Ag

Ab

*Ag

Ag-Ab++标记抗原（F）特异性抗体被检抗原非标记抗原抗体复合物标记抗原抗体复合物（B）

*Ag-Ablimited,competitive

1.1放射免疫分析（RIA）技术原理当前第10页\共有42页\编于星期三\5点抗原标准品与待测抗原结构---完全相同/结构相似且亲和力相近纯度---纯度90%以上（免疫纯）

较高的放射比放射性同位素特异性抗体

特异性高、亲和力高（Ka）、效价高

。“三高”！

1.2放射免疫技术基本条件当前第11页\共有42页\编于星期三\5点标记核素125I

3H射线γβ理化性活泼差核素丰度>90%－半衰期

60.2d12.3y标记方法简单复杂标记设备低廉(γ计数仪)昂贵(β液闪仪)测量条件简单

复杂当前第12页\共有42页\编于星期三\5点氯胺-T法：最常用的125I标记法，125I与酪氨酸共价结方法简便，但易造成蛋白质的损伤乳过氧化酶法（LPO）：标记方法更温和，对被标记物的生物活性影响125I-标记物的制备125I-标记物的纯化Sephadex层析，硅胶G薄板层析，HPLC分离当前第13页\共有42页\编于星期三\5点125I-标记物的鉴定比放射性：单位化学量标记物中所含的放射性强度;免疫活性：与过量抗体反应的百分比越大，标记物免疫活性越好当前第14页\共有42页\编于星期三\5点游离抗原与免疫复合物的分离第二抗体沉淀法

PEG沉淀法PR试剂法活性炭吸附法分离彻底，迅速分离试剂和过程不影响反应平衡效果不受反应介质影响操作应简单、重复性好经济当前第15页\共有42页\编于星期三\5点测量、数据处理晶体闪烁计数器包括了NaI闪烁晶体、光电倍增管以及计数器测量的放射性信号是仪器输出的电脉冲数：每分钟计数(cpm)

计算

参数cpmB/T(%)F/T(%)B/F(%)B/B0(%)拟合注：T即是B（标记的复合物）与F（标记抗原）的总和当前第16页\共有42页\编于星期三\5点

Ag*AbAg

标记抗原特异性抗体待测抗原(Ag*-Ab)+(Ag-Ab)抗原抗体复合物分离Ag*-Ab和游离Ag*从标准曲线上读知含量

测定Ag*-Ab和游离Ag*放射性

放射免疫测定法(RIA)示意图当前第17页\共有42页\编于星期三\5点

1.3放射免疫技术基本类型液相法平衡法（一步法）顺序加样法固相法当前第18页\共有42页\编于星期三\5点免疫放射分析技术

（immunoradiometricassay，IRMA）1968年，Miles和Hales应用同位素标记胰岛素抗体，成功检测牛血清中的胰岛素。Type

IRMARIA被标记物质抗体抗原抗体用量过量限量被检抗原相对分子量相对较大相对较小反应方式分步结合竞争结合B、F分离方法固相洗涤分离液相沉淀/吸附分离当前第19页\共有42页\编于星期三\5点2.1免疫放射技术基本条件标记抗体的制备

抗体亲和力要求不高固相抗原免疫吸附剂

对抗原吸附力强，对非特异性蛋白吸附少，结合过程中高度分散（重氮化纤维素，琼脂糖4B珠）当前第20页\共有42页\编于星期三\5点2.2免疫放射技术基本类型

经典IRMA）当前第21页\共有42页\编于星期三\5点双抗夹心法2.2免疫放射技术基本类型当前第22页\共有42页\编于星期三\5点放射免疫分析技术的灵敏度高、特异性强、精密度好,常用于各种激素、微量蛋白质、肿瘤标志物和药物等微量物质的测定。但由于放射污染和危害，常用核素半衰期短，试剂盒稳定期不长等诸多不足,RIA将逐渐被取代。放射免疫分析技术的应用当前第23页\共有42页\编于星期三\5点荧光免疫技术Immunofluorescencetechnique，IFA当前第24页\共有42页\编于星期三\5点Introduction:1958年，Riggs等合成了异硫氰酸荧光黄（fluorescentisothiocyanate，FITC）；Marshall对荧光标记方法进行了改进，荧光技术逐渐推广1942年，Coons等，异硫氰酸荧光素标记抗体，检测小鼠组织切片中可溶性肺炎链球菌多糖抗原IFA荧光素敏感可测抗原抗体反应特异性显微技术高度精确优点：特异性强，敏感性高，速度快，结果直观---病原微生物缺点：荧光标本保存难（淬灭）非特异性染色当前第25页\共有42页\编于星期三\5点荧光素具有共轭双键体系的化学结构通常处于最低能量状态---基态激发光（紫外光）照射，跃迁到激发态回到基态，释放光子能量（波长较长的可见光---荧光）

荧光免疫分析（IFA）技术原理当前第26页\共有42页\编于星期三\5点

荧光免疫分析（IFA）技术原理YYY当前第27页\共有42页\编于星期三\5点

一种有机或无机化学物质，其接受激发光后，能够以发射光形式产生明亮的荧光而作为染料使用。

各种荧光素都有各自的激发波长和发射波长。因发射波长不同而颜色不同。

异硫氰酸荧光黄（FITC），四乙基罗丹明（Rb200），藻红蛋白（PE）。

荧光免疫分析（IFA）基本条件

1.荧光素当前第28页\共有42页\编于星期三\5点较高较稳定的荧光效率具有能与蛋白质分子形成稳定共价键的化学基团与蛋白质结合简单快速结合产物的荧光颜色与实验对象的自发荧光对比鲜明结合物具有一定的耐贮藏性

标记用荧光素应具备的条件当前第29页\共有42页\编于星期三\5点抗体：特异性强、效价高、标记后活性高标记前：梅花状双扩测效价标记抗体种类：多克隆抗体、单克隆抗体、葡萄球菌A蛋白（荧光二抗通用试剂）

2.待标记抗体1mg/mL当前第30页\共有42页\编于星期三\5点FITC（异硫氰酸荧光黄）标记抗体

Marsshall法

原理当FITC在碱性溶液中与抗体反应时，主要是抗体分子上的赖氨酸-氨基与FITC上硫碳胺键结合，一个IgG分子中有86个赖氨酸残基，一般最多能结合15～20个。

3.荧光标记抗体制备与纯化

荧光素-FITC-N＝C＋N-蛋白质FITC-N–C–N-蛋白质

‖‖SHHHSH

当前第31页\共有42页\编于星期三\5点

操作流程抗体的准备：20mg/ml(抗体+生理盐水+碳酸盐缓冲液）

碳酸盐缓冲液为总量的1/10。荧光素的准备：根据欲标记的蛋白总量，每毫克加入0.01mgFITC

（抗体与荧光素比例为50-100:1）标记：边搅拌边将称取的荧光素加入抗体溶液中（5-10min)。避免粘于瓶壁或搅拌棒上，继续搅拌12-18h，4℃透析：离心去沉淀，装入透析袋pH8.0缓冲盐水透析过夜，0-4℃过柱：葡萄糖凝胶G50或G25柱分离游离荧光素保存：4℃-40℃等量甘油分装保存。

3.荧光标记抗体制备与纯化当前第32页\共有42页\编于星期三\5点

4.荧光标记抗体鉴定1特异性染色效价测定--与相应抗原标本染色2非特异性染色测定--与相类似抗原标本染色3吸收试验---在荧光抗体中加入过量抗原，吸收后再用相应抗原阳性标本染色，结果无明显阳性荧光。4F/P比值的测定方法F（荧光素）和P（抗体蛋白）的克分子比值反映荧光抗体的特异性染色质量，

F/P=1-2，过高------非特异染色增强；过低------荧光很弱，降低敏感性。当前第33页\共有42页\编于星期三\5点

经典荧光抗体染色法当前第34页\共有42页\编于星期三\5点流式细胞仪（FlowCytometor,FCM），以荧光免疫技术为基础发展起来的专门的细胞分析技术。是一项集液流喷射技术、激光技术、电子物理技术、光电测量技术、计算机技术以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的检测仪器。

现代免疫荧光技术

1.流式细胞技术当前第35页\共有42页\编于星期三\5点1.流动室及液流驱动系统2.激光光源及光束形成系统3.光学系统4.信号检测与存贮、显示、分析系统5.细胞分选系统

流式细胞仪工作原理当前第36页\共有42页\编于星期三\5点荧光染色的细胞（微粒）悬液标本HighPressure流动室及液流驱动系统当前第37页\共有42页\编于星期三\5点若干组透镜、滤光片、小孔---将不同波长的荧光信号送入到不同的电子探测器当前第38页\共有42页\编于星期三\5点

单细胞分析：任何单细胞悬液，如血液、骨髓、体液中的细胞、培养细胞，实体组织经处理后制成单细胞悬液。快速分析：极短时间内可分析大量细胞，只要标本中的细胞数量足够，流式细胞仪可以每秒钟数十、数百、数千个细胞的速率进行测量，测量的细胞总数可达数千、数万乃至数百万个。

流式细胞技术应用当前第39页\共有42页\编于星期三\5点多参数分析：可同时分析单个细胞的多种特征,当同时用多种分子探针,如用不同荧光素标记的不同单克隆抗体进行多色荧光染色,通过流式细胞分析,即可获得单细胞的多种信息,使细胞亚群的识别、计数等更为准确。定性或定量分析：通过荧光染色对单细胞的某些成分如DNA含量、抗原或受体表达量、Ca2+浓度等均可进行单细胞水平的定性与定量