核酸提取及常见问题分析

核酸提取及常见问题分析演示文稿当前第1页\共有63页\编于星期三\6点优选核酸提取及常见问题分析ppt当前第2页\共有63页\编于星期三\6点DNA提取及常见问题分析

RNA提取及常见问题分析讲座内容当前第3页\共有63页\编于星期三\6点DNA提取

及常见问题分析TIANGENBIOTECH(BEIJING)CO.,LTD.当前第4页\共有63页\编于星期三\6点DNA提取的原则

DNA提取的方法

DNA提取常见问题分析DNA提取及常见问题分析当前第5页\共有63页\编于星期三\6点

保证DNA一级结构的完整性排除其它分子的污染

RNA、蛋白质、多糖等DNA提取的原则当前第6页\共有63页\编于星期三\6点基因组DNA的提取

CTAB法

SDS法质粒DNA的提取碱裂解法煮沸法线粒体、叶绿体DNA的提取差速离心结合SDS裂解法DNA提取的方法当前第7页\共有63页\编于星期三\6点基因组DNA提取主要方法CTAB法适用于植物组织，真菌等

SDS法适用于动物组织，血液，细胞，细菌，酵母等当前第8页\共有63页\编于星期三\6点CTAB法(植物DNA提取经典法)原理CTAB（hexadecyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。该复合物在高盐溶液中（>0.7mol/LNaCl）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。注：CTAB溶液在低于15℃时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。当前第9页\共有63页\编于星期三\6点

CTAB提取缓冲液的经典配方

组份Tris-HCl（pH8.0）

EDTA（pH8.0）NaClCTABβ-巯基乙醇

终浓度100mM20mM1.4M2%(W/V)0.1%（V/V）使用前加入Tris-HCl（pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl

提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中；CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除基因组DNA－CTAB法当前第10页\共有63页\编于星期三\6点

CTAB提取缓冲液的改进配方

组份Tris-HCl（pH8.0）

EDTA（pH8.0）NaClCTABPVP40β-巯基乙醇

终浓度100mM20mM1.4M3%(W/V)5%(W/V)2%（V/V）使用前加入PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。基因组DNA－CTAB法当前第11页\共有63页\编于星期三\6点CTAB法流程图植物材料裂解液上层溶液液氮研磨抽提细胞裂解干燥溶解离心洗涤酒精沉淀DNA溶液当前第12页\共有63页\编于星期三\6点植物基因组DNA提取试剂盒

缓冲液GP1缓冲液GP2去蛋白液GD洗脱缓冲液TE吸附柱CB2(20μg)收集管每个离心柱处理材料的量为鲜重：100mg干重：30mg当前第13页\共有63页\编于星期三\6点SDS法

原理SDS阴离子去垢剂

高温（55～65℃）裂解细胞，蛋白变性，染色体离析高盐(KAc或NH4Ac)或降低温度（冰浴）

使蛋白质及多糖杂质沉淀上清液中的DNA用酚/氯仿抽提

乙醇沉淀水相中的DNA当前第14页\共有63页\编于星期三\6点

组份Tris-HCl（pH8.0）

EDTA（pH8.0）NaClSDS

终浓度100mM20mM1.4M2%(W/V)SDS提取缓冲液的配方Tris-HCl（pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl

提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中；SDS裂解细胞，使蛋白变性，染色体离析；当前第15页\共有63页\编于星期三\6点动物组织细胞裂解液上层溶液抽提细胞裂解干燥溶解离心洗涤酒精沉淀DNA溶液组织匀浆SDS法流程图当前第16页\共有63页\编于星期三\6点细菌基因组DNA提取试剂盒血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒病毒基因组提取试剂盒酵母基因组DNA提取试剂盒

CB2：20(μg)SDS提取试剂盒当前第17页\共有63页\编于星期三\6点细菌基因组DNA提取试剂盒

1－5ml细菌菌液/离心柱10-40μg

血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒全血

100μl－1ml3-30μg动物细胞培养液106－107cells5-30μg动物组织30mg10-30μg病毒基因组提取试剂盒

DNARNA酵母基因组DNA提取试剂盒

Lyticase(20U/μg）不同材料对SDS提取试剂盒提取量当前第18页\共有63页\编于星期三\6点96血液基因组DNA试剂盒

一次实验可提取96个样品，快捷、方便。不同材料对SDS提取试剂盒提取量当前第19页\共有63页\编于星期三\6点基因组DNA－其它裂解方法

根据细胞裂解方式的不同有：物理方式：玻璃珠、超声波、研磨、冻融化学方式：异硫氰酸胍、碱裂解生物方式：酶法当前第20页\共有63页\编于星期三\6点基因组DNA纯化的方法

吸附材料结合法：吸附材料纯化原理硅质材料高盐低pH值结合核酸低盐高pH值洗脱阴离子交换树脂低盐高pH值结合核酸高盐低pH值洗脱磁珠磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物，从而达到分离目的当前第21页\共有63页\编于星期三\6点硅基质膜(离心柱型)DNA产物纯化试剂盒超薄普通大量寡核苷酸96CB1CB2CB3CB2CB25μg20μg40μg20μg20μg100bp-40kp100bp-40kp100bp-40kp20bp-10kb100bp-40kp当前第22页\共有63页\编于星期三\6点质粒DNA提取TIANGENBIOTECH(BEIJING)CO.,LTD.当前第23页\共有63页\编于星期三\6点

碱裂解法煮沸法当前第24页\共有63页\编于星期三\6点碱裂解法原理

染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分子，而质粒DNA为共价闭合环状分子；当用碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象；变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。当前第25页\共有63页\编于星期三\6点碱裂解法流程图对数期菌体溶液III中和溶液I充分重悬溶液II裂解上清液上层溶液抽提干燥溶解离心洗涤酒精沉淀质粒DNA溶液当前第26页\共有63页\编于星期三\6点离心柱型质粒DNA提取试剂盒小提小提中量大提高纯度小提高纯度小提中量无内毒素小提酵母1－5ml5-15ml100-200ml1-5ml5-15ml1－5ml1－5mlCB3CB4CB5CB3CB4CB3CB340μg70μg1000μg40μg70μg40μg40μg去蛋白液去蛋白液去内毒素树脂去蛋白液Lyticase当前第27页\共有63页\编于星期三\6点96系列96高纯质粒小提试剂盒96快速质粒小提试剂盒96个样品96个样品去蛋白液CB3(40μg)异丙醇或者酒精沉淀当前第28页\共有63页\编于星期三\6点细胞器DNA提取TIANGENBIOTECH(BEIJING)CO.,LTD.当前第29页\共有63页\编于星期三\6点细胞器DNA

线粒体叶绿体差速离心法原理是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法。将待分离物质置于均匀介质（蔗糖）中，以一定的转速进行离心，比重大的物质优先沉降，比重小的却处于上层，从而得以分离。当前第30页\共有63页\编于星期三\6点材料准备细胞裂解核酸分离纯化核酸沉淀核酸溶解保存DNA提取基本步骤当前第31页\共有63页\编于星期三\6点

基因组DNA新鲜材料，低温保存血液基因组DNA提取选择有核细胞细胞培养时间不能过长含病毒的液体材料提取前先富集

质粒DNA对数期的菌体培养时应加入筛选压力低拷贝或大质粒，应加大菌体用量菌株不要频繁转接（质粒丢失）材料准备细胞裂解核酸分离纯化核酸沉淀核酸溶解保存DNA提取基本步骤当前第32页\共有63页\编于星期三\6点

基因组DNA材料过多影响裂解，导致DNA量少，纯度低针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：植物材料－－液氮研磨动物组织－－匀浆或液氮研磨组培细胞－－蛋白酶K细菌－－溶菌酶破壁酵母－－破壁酶或玻璃珠

质粒DNA菌体量适当，除净培养基变性的时间不要过长（5分钟）控制复性时间，避免基因组DNA的污染G＋菌、酵母细胞酶或机械处理材料准备细胞裂解核酸分离纯化核酸沉淀核酸溶解保存DNA提取基本步骤当前第33页\共有63页\编于星期三\6点采用吸附材料吸附分离DNA，应提供相应的缓冲体系采用有机溶剂（酚/氯仿）抽提时应充分而轻柔的混匀离心分离两相时，应保证一定的转速和时间针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法材料准备细胞裂解核酸分离纯化核酸沉淀核酸溶解保存DNA提取基本步骤当前第34页\共有63页\编于星期三\6点蛋白质的去除：酚/氯仿抽提使用变性剂（SDS、异硫氰酸胍等）蛋白酶处理材料准备细胞裂解核酸分离纯化核酸沉淀核酸溶解保存DNA提取基本步骤当前第35页\共有63页\编于星期三\6点多糖的去除：多糖水解酶在提取缓冲液中加1/2体积氯苯，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖。用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500μLDNA液中加入200μl20%PEG8000(含1.2MNaCl)，冰浴20min。材料准备细胞裂解核酸分离纯化核酸沉淀核酸溶解保存DNA提取基本步骤当前第36页\共有63页\编于星期三\6点多酚的去除：加入还原剂：β-巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等加入易与酚类结合的试剂：如PVP、PEG，可防止酚类与DNA的结合盐离子的去除：70％的乙醇洗涤材料准备细胞裂解核酸分离纯化核酸沉淀核酸溶解保存DNA提取基本步骤当前第37页\共有63页\编于星期三\6点预冷的乙醇或异丙醇更充分沉淀加入1/10体积的NaAc（pH5.2，3M）更充分沉淀晾干DNA，让乙醇充分挥发材料准备细胞裂解核酸分离纯化核酸沉淀核酸溶解保存

若长期储存建议使用TE缓冲液溶解

pH值为8.0，可防止DNA发生酸解DNA提取基本步骤当前第38页\共有63页\编于星期三\6点问题一：DNA降解材料不新鲜、反复冻融或细胞衰老提取操作过于剧烈，DNA被打断外源核酸酶污染低温保存，避免反复冻融液氮研磨或匀浆组织，应在解冻前加入裂解缓冲液增加裂解液中螯合剂的含量细胞裂解后操作应尽量轻柔试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌DNA分装保存于缓冲液，避免反复冻融当前第39页\共有63页\编于星期三\6点问题二：DNA样品不纯DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应DNA中残留有金属离子重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质（具体方法见前）重新沉淀DNA，让酒精充分挥发增加70％乙醇洗涤的次数（2-3次）当前第40页\共有63页\编于星期三\6点实验材料不佳或量少破壁或裂解不充分沉淀不完全洗涤时DNA丢失尽量选用新鲜（幼嫩）的材料动植物要匀浆研磨充分；G＋菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁高温裂解时，时间适当延长（对于动物细胞、细菌可增加PK的用量）低温沉淀，延长沉淀时间加辅助物，促进沉淀洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒问题三：DNA提取量少当前第41页\共有63页\编于星期三\6点RNA提取

及常见问题分析TIANGENBIOTECH(BEIJING)CO.,LTD.当前第42页\共有63页\编于星期三\6点

RNA提取相关知识及注意事项

RNA提取方法

RNA提取常见问题分析当前第43页\共有63页\编于星期三\6点

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个细胞10μg30mg动物组织，

30-100mg植物组织rRNA占80－85％mRNA占1-5%AAAAAA细胞中RNA的含量AAAAAAtRNAmRNArRNARNAase当前第44页\共有63页\编于星期三\6点mRNA的应用RT-PCR,Northern杂交，cDNA文库构建

mRNA末端快速扩增(RACE)，差异表达(DDRT-PCR)，引物延伸反应，体外转录RNA标记，RNA酶保护试验，RNA微注射(RNAMicroinjection)当前第45页\共有63页\编于星期三\6点

RNA的不稳定性内因：核糖残基的2’和3’位置带有羟基，易被水解外因：内源、外源RNA酶含量丰富，加热后仍能够正确折叠恢复活性，不易失活当前第46页\共有63页\编于星期三\6点常用的RNA酶抑制剂焦碳酸二乙酯（DEPC）与RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，强烈但不彻底的RNA酶抑制剂

异硫氰酸胍目前是最有效的RNA酶抑制剂，裂解组织的同时也使RNA酶失活。当前第47页\共有63页\编于星期三\6点RNasin

从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。可以和多种RNA酶结合，使其失活氧钒核糖核苷复合物由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性

SDS、尿素、硅藻土等常用的RNA酶抑制剂当前第48页\共有63页\编于星期三\6点RNAsafeRNA酶抑制剂当前第49页\共有63页\编于星期三\6点提取RNA的注意事项

经常更换新手套。皮肤和实验室用品上可能有RNase，会导致RNase污染塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡4-10小时，再灭菌玻璃器皿可在180℃烘烤4小时塑料制品和枪头避免交叉污染当前第50页\共有63页\编于星期三\6点RNA提取相关知识及注意事项

RNA提取方法

RNA提取常见问题分析当前第51页\共有63页\编于星期三\6点异硫氰酸胍/苯酚法细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放释放出来的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分离当前第52页\共有63页\编于星期三\6点动植物材料研磨或匀浆细胞裂解基因组DNA水相有机相RNA氯仿纯化pH5.7离心加入裂解液(TRNzol)RNA提取流程示意图当前第53页\共有63页\编于星期三\6点等体积异丙醇沉淀70％乙醇洗涤沉淀晾干溶解RNA吸附柱去蛋白液漂洗洗脱水相RNA传统方法：有机溶剂抽提，得率高柱纯化法：纯度高，无有机溶剂RNA提取流程示意图当前第54页\共有63页\编于星期三\6点TRNzol(DP405)RNAprep(DP401)RNAultra(DP406)RNAprep(DP402)RNAplant(DP407)普遍适用动物组织富含多糖和酚类的植物组织50-100mg/500μl30-100mg/离心柱30-100mg/离心柱50-100mg/1ml可选择的RNA提取产品当前第55页\共有63页\编于星期三\6点材料准备TRNzol裂解细胞加入氯仿抽提RNA沉淀柱纯化RNA溶解保存植物组织选取杂质少生长较快的幼嫩部位培养细胞除尽培养液消化系统的组织选取杂质少的部位细菌和酵母需要破壁处理样品切成小块投入液氮或专门的RNA样品储存液中保存液氮研磨时不要使液氮挥发净RNA提取基本步骤当前第56页\共有63页\编于星期三\6点材料准备TRNzol裂解细胞

加入氯仿抽提RNA沉淀柱纯化RNA溶解保存异硫氰酸胍、酚