基因工程第二章基因工程的工具酶

（优选）基因工程第二章基因工程的工具酶当前第1页\共有51页\编于星期三\2点限制性内切酶作为细菌体内保护自身、避免被噬菌体入侵的作用机制。当前第2页\共有51页\编于星期三\2点一、限制性内切酶的命名和种类1.命名：生物的属名的第一个字母和种名的第一、二个字母命名，菌株的代号的一个字母，和罗马数字表示。当前第3页\共有51页\编于星期三\2点EcoRIEscherichia属名Coli种类Ry13株系编号第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株名；用罗马数字表示发现的先后次序。当前第4页\共有51页\编于星期三\2点2.限制性内切酶的种类：平端5′突出粘端3′突出粘端当前第5页\共有51页\编于星期三\2点识别序列：在双链DNA分子能够识别的特殊核苷酸序列;一般为4-8bp1）二重旋转对称识别序列（回文序列）当前第6页\共有51页\编于星期三\2点3.限制酶的特点

1).识别顺序和酶切位点

①识别４-8个相连的核苷酸

MboINGATCN；AvaIIGG(A/T)CCBamHIGGATCC：PpuMIPuGG(A/T)CCPyNotIGCGGCCGC；

SfiIGGCCNNNNNGGCCCCGGN’N’N’N’N’CCGG

FokI5’-ＧＧＡＴＧ(Ｎ)9-3’3’-ＣＣＴＡＣ(Ｎ)13-5’外侧，产生５’-端突起２）富含ＧＣ当前第7页\共有51页\编于星期三\2点

３）对称性—双对称

EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’

４）切点大多数在识别顺序之内，也有例外

５）限制酶切后产生两个末端，末端结构是５’-Ｐ和３’-ＯＨ

2).

末端种类

１）３’-端突起，个数为２或４个核苷酸

PstI5’-CTGCAG-3’5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’3’-GACGTC-5’

２）５’-端突起，个数为２或４个核苷酸

EcoRI

5’-GAATTC-3’5’-GOH

PAATTC-3’3’-CTTAAG-5’3’-CTTAAP

HOG-5’当前第8页\共有51页\编于星期三\2点３）

平齐末端

SmaI5’-CCCGGG-3’5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’3’-GGGCCC-5’

４）非互补的粘性末端ａ）切点在识别顺序之外的，如：FokIFokI5’-GGATG(Ｎ)9-3’5’-GGATG(N)93’-CCTAC(Ｎ)13-5’3’-CCTAC(N)13

ｂ）能识别简并顺序的，如：AvaI

AvaI

5’-CPyCGPuG-3’

CCCGGG;CTCGGG;CCCGAG;CTCGAG

当前第9页\共有51页\编于星期三\2点５）相容性末端如：BamHIGGATCCBglII

AGATCTMboI,Sau3AINGATCN

上述几种限制酶产生的DNA片段仍可相连，由此形成的重组分子能被MboI和Sau3AI识别和酶切，但BamHI和BglII的识别机率只有1/16。

BamHI+MboIA/C/G/TGATCT/C/G/A

BamHI和BglII(AGATCT)两种酶产生的相容性末端，相连后不能为两种酶所识别和酶切。

BamHI+BglIIA/GGATCT/C

不同末端的连接特性:除第4种末端不能进行不同DNA分子或同种DNA分子不同切点产生的末端相连外，其余4种末端可以相互连接。当前第10页\共有51页\编于星期三\2点4.同尾酶(Isocaudamer)有些来源不同的限制酶，识别及切割序列各不相同，但却能产生出相同的粘性末端。MunI：5`-CAATTG-3`3`-GTTAAC-5`EcoRI：5`-GAATTC-3`3`-CTTAAG-5`5`-CAATTG-3`3`-GTTAAC-5`5`-GAATTC-3`3`-CTTAAG-5`重新连接后的序列：5`-CAATTC-3`3`-GTTAAG-5`两种同裂酶切割形成的DNA片段经连接后所形成的重组序列，能否被原来的限制酶所识别和切割？当前第11页\共有51页\编于星期三\2点5.异源同序酶（Isoschizomer，同裂酶）

1.定义：能识别相同序列但来源不同的两种或多种限制酶

2.特点：1）识别相同顺序

2）切割位点的异同

KpnIGGTACCAsp718GGTACCSstICCGCGGSacICCGCGG

6.限制酶的星反应（Staractivity）

1.

特点:限制酶识别序列特异性降低

2.

发生星反应的限制酶和条件（见下页）

3.

星反应的利用和避免当前第12页\共有51页\编于星期三\2点表1具有星反应的限制性内切酶与条件限制酶诱发星活性的条件a识别序列AvaI1,2,4BamHI1-5,8GGATCN,GPuATCCBstI2,4BsuI2,4,6EcoRI1,2,4-6NAATTNHaeⅢ2,4HhaI2,4,7HindⅢ6HpaI1,2,4PstI1,2,4,7PvuⅡ2,4SalI1,2,4,7ScaI4-6,8SstⅡ2,4XbaI2,4,7a.1：亚乙二醇(45%)；2:甘油(12%)；3：乙醇(12%)；4：高酶/DNA比(>25U/μg)；

5：Mn++代替Mg++；6:pH8.5;7:二甲基亚砜(8%);8:无NaCl。

当前第13页\共有51页\编于星期三\2点3.限制性内切酶作为基因工程常用工具酶的机制：当前第14页\共有51页\编于星期三\2点当前第15页\共有51页\编于星期三\2点3.定向克隆的机制：当前第16页\共有51页\编于星期三\2点4.利用噬菌体克隆大片段DNA的机制：当前第17页\共有51页\编于星期三\2点当前第18页\共有51页\编于星期三\2点5.重组DNA片段的检测：1）抗药性筛选当前第19页\共有51页\编于星期三\2点2）显色性筛选当前第20页\共有51页\编于星期三\2点当前第21页\共有51页\编于星期三\2点1.底物DNA：DNA的纯度、分子构型、识别序列的侧面序列、位点的偏爱和DNA甲基化有关系。2.限制性内切酶的用量：酶的活性单位：（U/μl）3.反应体系：20μl

DNA：3.0μl（1.0μg）

10XBuffer：2.0μl

Enzyme：0.5μl

ddH2O：14.5μl二、限制性内切酶的反应体系当前第22页\共有51页\编于星期三\2点4.双酶切法：DNA：3.0μl（1.0μg）

10XBuffer：2.0μl

Enzyme1：0.5μl

Enzyme2：0.5μl

ddH2O：14.0μl5.双酶切注意事项：1）两个酶通用缓冲液中的活力；2）用量的控制；当前第23页\共有51页\编于星期三\2点6.具体操作时应注意事项：①整个操作应在0℃进行，即在冰浴中进行，而且是在加入其它试剂之后，最后加入酶。②当切割大量DNA时，通常采用延长反应时间，减少酶的用量。③当DNA需2种或以上酶切时，应用通用缓冲液，若没有通用缓冲液时，只有用1种酶切完后，纯化酶切产物，再进行下一个酶切反应。

当前第24页\共有51页\编于星期三\2点限制酶在各种缓冲液中的相对活性

当前第25页\共有51页\编于星期三\2点DoubleDigestion(双酶切反应)时UniversalBuffer(通用缓冲液)的使用表

当前第26页\共有51页\编于星期三\2点7.对酶切结果进行分析

通过限制性酶切可以得到一定数量的DNA片断，DNA带负电荷，因此，当DNA分子被置于电场中时它们就会向阳极迁移。这样就可以通过凝胶电泳对酶切DNA片段进行分离。当前第27页\共有51页\编于星期三\2点当前第28页\共有51页\编于星期三\2点当前第29页\共有51页\编于星期三\2点内切酶在DNA上的所有识别位点都被切开。

完全消化（CompleteDigestion）12341234当前第30页\共有51页\编于星期三\2点只有有限数量的酶切位点被切开。通过缩短保温时间、降低反应温度或减少酶的用量可达到局部消化的目的。

局部消化123414部分酶切（PartDigestion）当前第31页\共有51页\编于星期三\2点第二节DNA连接酶（DNALigase）

1967年，世界上数个实验室几乎同时发现该酶。2.1基本性质：能将两段DNA拼接起来的酶，催化DNA相邻的5‘磷酸基团和3’羟基末断之间形成磷酸二酯键，封闭DNA单链缺口。当前第32页\共有51页\编于星期三\2点2.2T4DNA连接酶的作用机制：①ATP+DNAligase(E)→E-AMP+PPi。②E-AMP上的AMP转移到DNA的5’磷酸根上，使其活化，释放出酶。③活化的5’磷酸根与相邻的3’羟基形成3’,5’-磷酸二酯键，并释放出AMP。

当前第33页\共有51页\编于星期三\2点当前第34页\共有51页\编于星期三\2点

8.1.3两种DNA连接酶比较

T4DNAligaseE.coliDNAligase来源T4

噬菌体大肠杆菌分子量68kD75kD辅助因子ATPNAD+底物1)双链DNA分子的粘、平端1)同源互补粘端

2)RNA-DNA杂合体、RNA链缺口2)双链分子中的单链缺口

3)双链DNA分子中的单链缺口应用范围广泛.效率高窄当前第35页\共有51页\编于星期三\2点修复双链DNA缺口处的磷酸二酯键当前第36页\共有51页\编于星期三\2点修复与RNA结合的DNA链上缺口处的磷酸二酯键当前第37页\共有51页\编于星期三\2点连接多个平头双链DNA分子：当前第38页\共有51页\编于星期三\2点注意：DNA连接酶不能连接两条单链的DNA分子或环化的单链DNA分子，被连接的必须是双螺旋DNA分子的一部分。当前第39页\共有51页\编于星期三\2点2.3DNA片段之间的连接2.3.1具互补黏性末端片段之间的连接基本原理：用DNA连接酶连接具有互补粘性末端DNA片段。当前第40页\共有51页\编于星期三\2点2.4具平末端DNA片段之间的连接基本原理：直接用T4DNA连接酶连接.

当前第41页\共有51页\编于星期三\2点2.5DNA片段末端修饰后进行连接1)DNA末端同聚物加尾后进行连接基本原理：利用末端脱氧核苷酸转移酶转移核苷酸的特殊功能在DNA的末端加尾。当前第42页\共有51页\编于星期三\2点当前第43页\共有51页\编于星期三\2点2)黏性末端修饰成互补粘端或平末端后进行连接基本原理：

采用两种方法①修平：用核酸酶切除双链DNA分子的突出核苷酸，修平后用T4连接酶作平末端连接。②补平：用Klenow酶将粘端补平，产生平末端或匹配粘端，再用T4连接酶进行连接。当前第44页\共有51页\编于星期三\2点当前第45页\共有51页\编于星期三\2点

HindIII↓

↓XbaI

5’----ACTAGA----3’

3’----TTCGA

T----5’ dATP dTTPKlenowdGTPdCTPKlenow5’----AAG

CTAGA----3’3’----TTCGA

TCT----5’

T4DNAligase