慢性乙型病毒性肝炎患者外周血T淋巴细胞亚群CD27和CD28的表达

慢性乙型病毒性肝炎患者外周血T淋巴细胞亚群CD27和CD28的表达【摘要】目的分析慢性乙型病毒性肝炎患者外周血T淋巴细胞亚群CD27和CD28的表达，初步探讨其分化表型。方法采集分离健康人和慢性乙型病毒性肝炎患者外周血单个核细胞(PBMC)，利用多种荧光标记抗体标记细胞表面分子，再用流式细胞仪检测CD8+和CD4+T淋巴细胞表面CD27和CD28分子的表达。结果31例慢性乙型病毒性肝炎患者CD8+CD27+CD28+T细胞占CD8+T细胞(±)%，低于28例健康对照组的(±)%()。而CD8+CD27-CD28-T细胞占CD8+T细胞(±)%，显着高于健康对照组的(±)%()。慢性乙型病毒性肝炎患者CD4+CD27+CD28+T细胞(±)%和健康对照组(±)%比较，差异无统计学意义。结论健康人外周血T淋巴细胞以CD27+CD28+早期分化表型为主。而慢性乙型病毒性肝炎患者外周血中不同的亚群分化特征又有所不同，CD4+T淋巴细胞的分化表型仍然以CD27+CD28+早期分化表型为主，而CD8+T淋巴细胞中早期分化表型明显减少，晚期分化表型(CD27-CD28-)显着增加。

【关键词】慢性乙型病毒性肝炎淋巴细胞CD27CD28分化表型

【Abstract】ObjectiveToanalyzethedifferentiationphenotypeofperipheralbloodTlymphocytesinpatientswithchronichepatitisBvirus(HBV)byanalysingexpressionsofCD27andCD28.MethodsPeripheralbloodmononuclearcells(PBMC)wereisolatedfromnormalindividualsandpatientswithchronicHBV.Thecellsurfacemoleculewaslabeledwithmultiplefluorescentlabelingantibodies.FlowcytometrywasusedtodetecttheexpressionsofCD27andCD28onthesurfacesofTlymphocytesCD8+andCD4+.ResultsThefrequencyofCD8+CD27+CD28+TcellsinpatientswithchronicHBVwas(±)%,significantlylowerthan(±)%inhealthycontrol(),whilethefrequencyofCD8+CD27-CD28-Tcellswasonthecontrary,ie,(±)%vs(±)%().NodifferencewasfounduponthefrequencyofCD4+CD27+CD28+TcellsbetweenpatientswithchronicHBVandhealthycontrol,ie,(±)%vs(±)%().ConclusionsBothCD4+andCD8+Tlymphocytesinhealthycontroldemonstrateaclearenrichmentoftheearlydifferentiationphenotype.PatientswithchronicHBVrepresentdifferentphenotypicsubsets.EarlydifferentiationphenotypeofCD27+CD28+isdominatedindifferentiationphenotypeofCD4+Tlymphocytes.WhileCD8+Tlymphocytesshowdecreasedearlydifferentiationphenotypebutsignificantlyincreasedlatedifferentiationphenotype(CD27-CD28-).

【Keywords】ChronichepatitisB;Tlymphocytes;CD27;CD28;Differentiationphenotype

乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus，HBV)在全球范围内严重威胁着人类的健康，约20亿人已感染HBV。每年约有100万人死于HBV感染慢性化所致肝衰竭、肝硬化和原发性肝细胞癌。我国属HBV感染高流行区，现有HBV携带者约亿，每年约有35万人死于与HBV相关的疾病。

HBV是一种非细胞病变性DNA病毒，感染人体后出现不同的临床转归。这可能取决于病毒和宿主两方面因素。宿主的细胞免疫应答对感染的发展和转归有着重要的影响。因此，研究HBV慢性感染患者外周血中T淋巴细胞的特性，不仅促进我们了解HBV感染过程和机体抗病毒的免疫应答机制，而且有利于探索新型有效的抗病毒免疫治疗方案。

基于细胞表面不同的分子，分析病毒感染中T细胞的分化表型对T淋巴细胞特性功能的研究有重要意义［1］。本文利用CD27/CD28分子分化模式研究HBV慢性感染患者外周血中T淋巴细胞的分化表型，对HBV感染慢性化的机制进行探索。

1材料与方法

研究对象

收集西南医院肝胆外科和重庆市传染病院慢性乙型病毒性肝炎患者31例，其中男性25例，女性6例；年龄25～67岁(平均岁)。经检测HBsAg阳性，HBcAgIgG阳性，或者HBVDNA阳性。诊断标准参照2000年第十届全国传染病和寄生虫肝病分会联合修订的病毒性肝炎防治方案，同时排除合并其他类型肝炎病毒感染、酒精性肝病、自身免疫性肝炎等疾病。正常对照组28名，均为健康献血者。

赵婷婷，等.慢性乙型病毒性肝炎患者外周血T淋巴细胞亚群CD27和CD28的表达主要试剂

淋巴细胞分离液购自AxisShield公司；荧光标记抗体(抗人CD8、CD4、CD27、CD28)购自BD公司(BDPharMingen，SanDiego，California)。

外周血单个核细胞(PBMC)分离

抽取静脉血，肝素抗凝，PBS等体积稀释后，用Ficoll进行密度梯度离心(800×g，30min)，获取PBMC，以PBS充分洗涤后，用含1%BSA的PBS重悬细胞。

细胞染色流式细胞仪分析

PBMC悬液中加入荧光标记抗体，同时设立阴性对照和同型对照组，4℃，避光孵育30min，洗涤2次后，重悬细胞，上机检测。应用流式细胞检测仪(BDFACDAria)检测，并用FCSexpress软件分析结果。

统计学处理

应用SPSS统计分析软件进行，各组标准化的样本数值用±s表示，各组间差异用t检验分析，P＜表示差异有统计学意义。

2结果

外周血CD8+T细胞表达CD27/CD28的流式分析结果

健康对照组PBMC中以CD8+CD27+CD28+T细胞为主(图1)，占CD8+T细胞的比例为%～%，平均(±)%，n＝28，见表1。

而慢性乙型病毒性肝炎患者CD8+T细胞中可见CD27+CD28+、CD27+CD28-、CD27-CD28-3种分化表型，其中以CD8+CD27+CD28+和CD8+CD27-CD28-居多(图2)。与健康对照组比较，发现慢性乙型病毒性肝炎患者PBMC中CD27+CD28+细胞占CD8+T淋巴细胞比例明显减少()，而CD27-CD28-细胞占CD8+T淋巴细胞则明显增加()。

外周血CD4+T细胞表达CD27/CD28的流式分析结果

健康对照组外周血单个核细胞中以CD4+CD27+CD28+T细胞为主(图1)，占CD4+T细胞的比例为%～%，平均(±)%，n＝28，见表1。慢性乙型病毒性肝炎患者PBMC中同样是以CD4+CD27+CD28+T细胞为主(图2)，占CD4+T细胞的比例为%～%，平均(±)%，n＝31，见表1。两者比较可见慢性乙型病毒性肝炎患者PBMCCD4+T细胞中CD27+CD28+T淋巴细胞的比例减少并不明显()。表1慢性乙型病毒性肝炎患者和健康对照组外周血CD27+CD28+T细胞亚群的比较

3讨论

T淋巴细胞分化模式

利用这种CD27/CD28分化模式，我们研究发现，慢性HBV感染患者的CD4+T细胞的分化表型与健康人没有差别，但是CD8+T细胞却有着显着差异。健康人CD8+T细胞以CD27+CD28+初始表型为主，而慢性HBV感染患者外周血中CD27+CD28+初始表型CD8+T细胞明显减少，取而代之的是大量CD8+CD27-CD28-晚期分化T细胞。

T淋巴细胞是免疫系统中最具异质性的细胞。其表面表达数百种不同的蛋白质，其中一些蛋白质随着T细胞发育阶段的不同以及成熟T细胞功能和活化状态的不同，其表达的形式和数量有所变化。这些分子与T细胞对抗原的识别、细胞的活化、增殖和分化以及T细胞效应功能的发挥相关。基于这些细胞表面分子，如CD45RA/RO、共刺激受体CD28/CD27，淋巴结归巢受体CD62L以及趋化因子受体CCR7等，研究者们将T淋巴细胞区分为不同分化表型的细胞亚群。近年来关于T细胞分化亚群的研究很多，但是记忆T细胞是如何从初始T细胞发展而来的问题，仍然存在争议，有两种不同的观点：①分歧模式［2］认为初始T细胞遭遇抗原后，一部分分化为效应细胞，发挥效应功能后凋亡；另一部分则直接分化为记忆细胞存活下来。②线性分化模式［3］则认为记忆T细胞由效应T细胞发展而来。两种模式均有各自的支持者。2002年，Appay等［4］人基于细胞表面分子CD27/CD28的联合表达，提出CD8+T细胞分化模式，就是典型的线性分化模式，将CD8+T淋巴细胞划分为早期初始T细胞(CD27+CD28+)、晚期T细胞(CD27-CD28-)和中期T细胞(CD27+/-CD28-/+)。Appay等［4］的研究还发现各种病毒感染初期，其特异性CD8+T细胞的分化表型均为早期初始型，但是随着感染慢性化，不同的病毒诱导T细胞分化停滞在不同阶段，EB病毒和丙型肝炎病毒特异性CD8+T细胞多为早期初始T细胞，而巨细胞病毒感染则富集晚期CD8+T细胞。人类免疫缺陷病毒特异性CD8+T细胞多为中期亚群，其机制并不清楚。

检测CD27和CD28分子表达的意义

CD27和CD28分子存在于外周成熟T细胞表面。CD28分子与表达在B细胞和抗原递呈细胞表面的B7分子结合，产生T细胞活化的辅助信号(协调刺激信号)，诱导T细胞活化。而CD27分子与其配体CD70可以作为第二信号促进T细胞增殖，还参与T细胞的分化过程。CD8+T淋巴细胞遭遇抗原刺激后活化，CD27和CD28分子不可逆的下调，分化为CD8+CD27-［5］和CD8+CD28-［6］，同时具备了效应细胞的功能，如分泌IFNγ和TNFα细胞因子，以及穿孔素和颗粒酶素等细胞毒分子。

但是随着研究不断深入和技术手段的不断改进，研究者们发现，CD8+CD27-和CD8+CD28-表型的细胞中不仅包含效应细胞，而且还有记忆细胞。联合CD45RA、CCR7、CD62L等分子，记忆细胞还可以进一步细化为中心记忆细胞和效应记忆细胞［7］。随着表型的细化，各个不同功能的亚群也分离开来。有一群老化细胞也具有CD8+CD28-的分化表型［8］，CD28的缺失表达是这群细胞的特征性标志。老化细胞的功能与效应细胞正好相反，增殖能力弱、细胞毒效应缺失，抗凋亡。在老年人和慢性感染性疾病患者等机体免疫力低下的人群体内老化细胞会增加。因此我们将利用tetramer技术和多色流式细胞仪技术深入研究HBV特异性CD8+T细胞慢性化阶段的表型和功能［9］，更能证明在HBV慢性感染诱导CD8+T细胞分化的特性。

综上所述，我们对HBV慢性感染患者外周血CD8+T细胞的分化表型做了初步的探讨发现初始表型CD8+T细胞减少，而晚期分化表型的CD8+T细胞显着增加，但是其分化表型与细胞功能和疾病进程的相关性，还需要我们进一步研究。CD4+Th1和Th2细胞分化调控近期取得突破性进展［10］，表观遗传学研究发现了调节两种细胞分泌不同细胞因子的基因，从而将Th1和Th2细胞的表型和功能联系起来。对CD8+T细胞而言，虽然近年来相关研究很多，但是表面分子和效应分子(Perforin、GranzymeB)在基因和蛋白水平的表达调控都不是十分清楚，因此CD8+T细胞分化表型和功能的相互关系还有待深入。

【参考文献】

［1］VanLierRA,TenBergeIJ,GamadiaLE.HumanCD8(+)Tcelldifferentiationinresponsetoviruses［J］.NatRevImmunol,2003,3(12):931-939.

［2］HuH,HustonG,DusoD,etal.CD4(+)Tcelleffectorscanbecomememorycellswithhighefficiencyandwithoutfurtherdivision［J］.NatImmunol,2001,2(8):705-710.

［3］ChampagneP,OggGS,KingAS,etal.SkewedmaturationofmemoryHIVspecificCD8Tlymphocytes［J］.Nature,2001,410(6824):106-111.

［4］AppayV,DunbarPR,CallanM,etal.MemoryCD8+Tcellsvaryindifferentiationphenotypeindifferentpersistentvirusinfections［J］.NatMed,2002,8(4):379-385.

［5］HamannD,BaarsPA,RepMH,etal.PhenotypicandfunctionalseparationofmemoryandeffectorhumanCD8+Tcells［J］.JExpMed,1997,186(9):1407-1418.

［6］PosnettDN,EdingerJW,ManavalanJS,etal.DifferentiationofhumanCD8Tcells:implicationsforinvivopersistenceofCD8+CD28-cytotoxic