东南大学电子学院《现代光学基础》补充内容3显微镜

OUTLINE7.1OpticalMicroscopy7.2ConfocalMicroscopy7.3ApplicationsofConfocalMicroscopyinBiomedicine当前第1页\共有73页\编于星期二\22点7.1OpticalMicroscopyThreegoals:produceamagnifiedimageofthespecimen,separatethedetailsintheimage,renderthedetailsvisibletothehumaneyeorcamera.Simplesinglelensdevicesthatareoftenhand-held,suchasamagnifyingglass.Multiple-lensdesignswithobjectivesandcondensers(compound)当前第2页\共有73页\编于星期二\22点Microscopy:HistorySimpleCompound当前第3页\共有73页\编于星期二\22点Microscopy:History当前第4页\共有73页\编于星期二\22点Microscopy:History当前第5页\共有73页\编于星期二\22点Microscopy:ImportanceBiomedicalsciences:overallmorphologicalfeaturesofspecimens;quantitativetooladvancesinfluorochromestainsandmonoclonalantibodytechniques:explosivegrowthintheuseoffluorescencemicroscopyinbothbiomedicalanalysisandcellbiology.opticalmicroscopemostimportantbiomedicalopticExplosivegrowthinphysicalandmaterialssciences;semiconductorindustry,

observesurfacefeaturesofhigh-techmaterialsandintegratedcircuitsForensicscientists:hairs,fibers,clothing,bloodstains,bullets,andotheritemsassociatedwithcrimes当前第6页\共有73页\编于星期二\22点SimpleMagnificationSo>>>2fSo>2fSo=2ff<So<2f当前第7页\共有73页\编于星期二\22点ImageformationonRetinado~25cm当前第8页\共有73页\编于星期二\22点CombinationofLensandEyeSimplemicroscope:bi-convexlens,imageperceivedbyeyeasifitwereatadistanceof10inchesor25centimeters(nearpoint)Imageappearsonsamesideoflensasobject,cannotbeprojectedontoascreen:virtualimage(upright,notinverted).Lightreflectedfromtheroseentersthelensinstraightlines,refractedandfocusedbythelenstoproduceavirtualimageontheretina.Imageoftherosemagnified:perceiveactualsizeofobjecttobeatinfinity;eyestracelightraysbackinstraightlinestovirtualimage

当前第9页\共有73页\编于星期二\22点CombinationofLensandEyeSofSilLMP=doDatl=f;DecreaselorL,increaseMP:MP=doD+1atl=0;L=doIncreaselorL,decreaseMP(D=1/f);do=nearpt~25cm当前第10页\共有73页\编于星期二\22点CompoundMicroscopeLensclosesttotheobject:objective.Lightfromcondenser,formslightconeconcentratedontotheobject(specimen).Lightpassesthroughthespecimenandintotheobjectiveprojectsareal,inverted,andmagnifiedimageofthespecimentoafixedplanewithinthemicroscope:intermediateimageplane当前第11页\共有73页\编于星期二\22点CompoundMicroscopeLfofeEyeorcameraMP=M(obj)M(e)=(-L/fo)(254/fe)当前第12页\共有73页\编于星期二\22点Airydisksandresolution.(a-c)Airydisksizeandrelatedintensityprofile(pointspreadfunction)asrelatedtoobjectivenumericalaperture,whichdecreasesfrom(a)to(c)asnumericalapertureincreases.(e)TwoAirydiskssoclosetogetherthattheircentralspotsoverlap.(d)Airydisksatthelimitofresolution.Airydisk当前第13页\共有73页\编于星期二\22点Resolutionr=1.2/2NA当前第14页\共有73页\编于星期二\22点7.2ConfocalMicroscopy当前第15页\共有73页\编于星期二\22点PrincipleofConfocalMicroscopy

当前第16页\共有73页\编于星期二\22点当前第17页\共有73页\编于星期二\22点当前第18页\共有73页\编于星期二\22点当前第19页\共有73页\编于星期二\22点PrincipleofCMThekeytechniquetoconfocalmicroscopy

SpatialFilteringTechniquesAdvantages(overconventionalwidefieldopticalmicroscopy)ControldepthoffieldEliminationorreductionofbackgroundinformationawayfromthefocalplaneCapabilitytocollectserialopticalsectionsfromthickspecimens当前第20页\共有73页\编于星期二\22点当前第21页\共有73页\编于星期二\22点HumanMedullaRabbitsunflowerMuscleFiberspollengrain当前第22页\共有73页\编于星期二\22点当前第23页\共有73页\编于星期二\22点当前第24页\共有73页\编于星期二\22点LasersThefarfieldbeginsatadistance,z,definedby(A(0)isthebeamdiameterattheexitapertureandlisthelaserwavelength)z=A02/l

当前第25页\共有73页\编于星期二\22点Wavelength(nm)BeamDiameter(mm)FarFieldDistance(cm)Argon-Ion4880.6745141.0195Helium-Neon5430.4305940.7836120.7806320.778Nd:YAG3553.025355321.0188Ti:Sapphire7902.05063952.010127900.881当前第26页\共有73页\编于星期二\22点Pinhole当前第27页\共有73页\编于星期二\22点ScanningSystem当前第28页\共有73页\编于星期二\22点Detectors当前第29页\共有73页\编于星期二\22点ResolutionandContrastResponseofAOpticalSystemPointSpreadFunction(PSF)Thepropertiesoftheintensitypointspreadfunctionintheimageplaneaswellasintheaxialdirectionaremajorfactorsindeterminingtheresolutionofamicroscope.IntensitypointspreadfunctionextendsinallthreedimensionsLateralcomponentsoftheintensitydistribution:Airydisk.当前第30页\共有73页\编于星期二\22点ResolutionandContrast当前第31页\共有73页\编于星期二\22点ResolutionandContrastOrderZeroCross-ingsPeaksI13.810027.01.7310.20.4413.30.2当前第32页\共有73页\编于星期二\22点ResolutionandContrast当前第33页\共有73页\编于星期二\22点ResolutionandContrastInWidefieldMicroscopeRayleighcriterion

forresolutionstatesthattwopointsareresolvedwhenthefirstminimum(zerocrossing)ofoneAirydiskisalignedwiththecentralmaximumofthesecondAirydisk.Thecontrastvalueis26.4percentrlateral=0.6l/NA

当前第34页\共有73页\编于星期二\22点ResolutionandContrastInconfocalconfigurations

PointwiseIlluminationScanning+PointwiseDetection

PSFconf.=PSFillum.*PSFdetc.~70%*PSFwidefieldTherefore,

rlateral=0.4l/NA

当前第35页\共有73页\编于星期二\22点ResolutionandContrastAxialResolutionWidefieldMicroscope:Noopticalsectioningcapability(a)ConfocalMicroscope:

Opticalsectioningcapability(b)当前第36页\共有73页\编于星期二\22点BenefitsofConfocalMicroscopyReducedblurringoftheimagefromlightscatteringIncreasedeffectiveresolutionImprovedsignaltonoiseratioZ-axisscanning,DepthperceptioninZ-sectionedimagesMagnificationcanbeadjustedelectronically当前第37页\共有73页\编于星期二\22点DrawbacksofConfocalMicroscopySloweracquisition-needtocollectonepixelatatimeIncreasedphotodamage(photobleaching)duetolongerexposuretoexcitinglight当前第38页\共有73页\编于星期二\22点HistoricalPerspective

ThebasicconceptofconfocalmicroscopyMarvinMinskyinthemid-1950s(patentedin1957)

M.DavidEggerandMojmirPetranmultiple-beamconfocalmicroscopeinthelate1960s

M.DavidEggerThefirstmechanicallyscannedconfocallasermicroscopeThefirstrecognizableimagesofcellsin1973.Thelate1970sandthe1980s

Growinginterestinconfocalmicroscopy.当前第39页\共有73页\编于星期二\22点HistoricalPerspectiveApplicationInstrumentsG.FredBrakenhoffdevelopedascanningconfocalmicroscopein1979whilealmostsimultaneously,ColinSheppardcontributedtothetechniquewithatheoryofimageformation.TonyWilson,BradAmos,andJohnWhitenurturedtheconceptandlater(duringthelate1980s)demonstratedtheutilityofconfocalimagingintheexaminationoffluorescentbiologicalspecimens.Thefirstcommercialinstrumentsappearedin1987.Duringthe1990s,thenumberofapplicationsthatcouldbetargetedwithlaserscanningconfocalmicroscopy.当前第40页\共有73页\编于星期二\22点Modernconfocalmicroscopes

Integratedelectronicsystemswheretheopticalmicroscopeplaysacentralroleinaconfigurationoneormoreelectronicdetectors,acomputer(forimagedisplay,processing,output,andstorage)severallasersystemscombinedwithwavelengthselectiondevicesabeamscanningassembly.当前第41页\共有73页\编于星期二\22点ModernconfocalmicroscopesAentireconfocalmicroscopeisoftencollectivelyreferredtoasadigitalorvideoimagingsystemcapableofpro-ducingelectronicimages.Employedforroutineinvestigationsonmolecules,cells,andlivingtissuesnow当前第42页\共有73页\编于星期二\22点当前第43页\共有73页\编于星期二\22点7.3ApplicationsinBiomedicine当前第44页\共有73页\编于星期二\22点荧光探针（Fluorescentprobe）

WhyneedFluorescentprobe?Stainsinfixedtissuesandlivingcells

Labelingantibodieswithfluorescentdyes－Immunofluorescence

Dyes,QuantumDots,….当前第45页\共有73页\编于星期二\22点FluorescenceExcitationandEmissionFundamentals

Luminescence

Photolumine-scence

FluorescencePhosphorescence

单光子激发荧光当前第46页\共有73页\编于星期二\22点TimescaleRangeforFluorescenceProcessesTransitionProcessRateConstantTimescale

(Seconds)S(0)=>S(1)orS(n)Absorption(Excitation)Instantaneous10-15S(n)=>S(1)InternalConversionk(ic)10-14

to10-10S(1)=>S(1)VibrationalRelaxationk(vr)10-12

to10-10S(1)=>S(0)Fluorescencek(f)orG10-9

to10-7S(1)=>T(1)IntersystemCrossingk(pT)10-10

to10-8S(1)=>S(0)Non-RadiativeRelaxation

Quenchingk(nr),k(q)10-7

to10-5T(1)=>S(0)Phosphorescencek(p)10-3

to100T(1)=>S(0)Non-RadiativeRelaxation

Quenchingk(nr),k(qT)10-3

to100当前第47页\共有73页\编于星期二\22点StokesShiftandMirrorImageRule当前第48页\共有73页\编于星期二\22点WhatisTPA?S1S0S10S1vS1S0S10S1vVirtualStateProcessofTwo-PhotonAbsorption双光子吸收（TPA）与双光子激发荧光当前第49页\共有73页\编于星期二\22点ApplicationsofTPAOpticalpowerlimitingFluorescenceImagingPhotodynamiccancertherapy

Microfabrication3Dopticaldatastorage当前第50页\共有73页\编于星期二\22点双光子荧光成像（续）

Hela细胞的双光子荧光像。染料为trans-4-[p-(9-ethylcarbazde)vinyl]-N-methypyrid-iniumIodide

当前第51页\共有73页\编于星期二\22点量子点

又称半导体纳米微晶粒，直径在1－100nm之间，能够吸收激发光产生荧光的半导体纳米颗粒

量子点荧光材料准零维尺度人造原子当前第52页\共有73页\编于星期二\22点量子点的结构（续）

CoreShellsCoatingPlay当前第53页\共有73页\编于星期二\22点量子点的性质与其它发光材料最大的区别：一种材料发多色光1）在发光范围内为目标光可连续可调2）通过调节量子点大小对发光谱调制Play当前第54页\共有73页\编于星期二\22点我们制备的不同尺寸的CdSe量子点在同一激发波长（365nm）下发出的荧光。

实验结果当前第55页\共有73页\编于星期二\22点样品（上图左起2、4、6）的紫外吸收光谱以及相应的荧光发射光谱（PL）样品2、4、6的荧光峰值和FWHM分别为：544.8nm、581.5nm、609.8nm和20.2、17.4、21.9实验结果当前第56页\共有73页\编于星期二\22点ApplicationsLSCM的高灵敏度、高分辨率、高放大倍数，提供了光学显微镜无法显示的结构，使细胞生物学研究上了一个台阶。目前我们可以在亚细胞水平进行动态实验，检测细胞生物质和离子通道的变化，观察细胞在生理、病理和药理情况下对外界因素作用所产生的快速反应，进行定性、定量、定时和定位的分析测量。最常用的功能是细胞三维重建，细胞荧光检测和细胞显微操作等

当前第57页\共有73页\编于星期二\22点细胞的三维重建（3-DReconstruction）LSCM能以0.1μm的步距沿轴向对细胞进行分层扫描，得到一组光学切片。通过计算机进行不同的三维重建算法，可作单色或双色图象处理，组合成细胞真实的三维结构。旋转不同角度可观察各侧面的表面形态，也可不同的断面观察细胞内部结构，测量细胞的长宽高、体积和断层面积等形态学参数。通过角度旋转和细胞位置变化可产生三维动画效果。当前第58页\共有73页\编于星期二\22点当前第59页\共有73页\编于星期二\22点当前第60页\共有73页\编于星期二\22点当前第61页\共有73页\编于星期二\22点细胞定量荧光测定LSCM以激光为光源，对细胞分层扫描，单独测定，经积分后能得到细胞荧光的准确定量，重复性极佳。它适于活细胞的定量分析。适用于快速高灵敏度测量，减少光粹灭的影响，在定量免疫荧光测定方面应用广泛，如作各种肿瘤组织切片抗原表达的定量分析，监测肿瘤相关抗原表达的定位定量信息，监测药物对肌体免疫功能的作用等。细胞定量荧光测定可选用单荧光。双荧光和三荧光方式，能自动测定细胞面积，平均荧光强度，积分荧光强度及形状因子等多种参数。

当前第62页\共有73页\编于星期二\22点细胞内钙离子PH值和其它离子的动态分析通过Indo－1、Fluo－2、Fluo－3、Calciumgreen、SNARF等多种荧光探针，可对细胞内钙离子、钠离子及PH值等作荧光标记并对它们进行比率值和浓度梯度变化测定。由于细胞内钙离子为传递信息的第二信使，对细胞生长分化起着重要作用，通过对细胞内钙离子和其它离子的荧光强度和分布精确测定，测定样品达到毫秒级的快速变化。借助光学切片功能可以测量样品深层的荧光分布以及细胞光学切片的生物化学特性的变化。当前第63页\共有73页\编于星期二\22点细胞胞间通讯（CellCommunication）和膜的流动性动物和植物细胞中缝隙连接介导的胞间通讯在细胞增殖和分化中起着重要作用。通过测量细胞缝隙连接分子的转移，可以研究肿瘤启动因子和生长因子对缝隙连接介导的胞间通讯的抑制作用及细胞内钙离子、pH值等对缝隙连接作用的影响，并监测环境毒素和药物在细胞增殖和分化中所起到的作用。细胞膜荧光探针受到极化光线激发后，发射光极性依赖于荧光分子的旋转，这种有序的运动自由度取决于荧光分子周围的膜流动性，所以极性测量能间接反映细胞膜的流动性。

当前第64页\共有73页\编于星期二\22点荧光光漂白恢复（Flu