浅论催产素预处理对胎鼠海马脑片缺氧无糖损伤后OTR、GABAARβ1表达的影响

浅论催产素预处理对胎鼠海马脑片缺氧无糖损伤后OTR、GABAARβ1表达的影响【摘要】目的：研究催产素(OT)预处理对胎鼠海马脑片缺氧无糖损伤后催产素受体(OTR)、γ氨基丁酸A受体β1亚基(GABAARβ1)表达的影响，探讨OT神经保护的作用机制。方法：采用胎龄20dSD大鼠海马脑片，实验组经含10-6mol·L-1OT人工脑脊液(ACSF)孵育预处理后行缺氧无糖损伤(OGD)，对照组经正常ACSF孵育后直接行OGD，各15min，SP免疫组化法半定量测定海马CA1区OTR、GABAARβ1表达变化，电镜观察神经元损伤情况。结果：实验组海马CA1区OTR、GABAARβ1表达均显着高于对照组(t=、P=;t=、P=)。对照组大量神经元受损,核固缩或碎裂，部分核膜溶解，实验组细胞核、粗面内质网、线粒体均较对照组有所改善,核膜较光滑,胞浆肿胀较对照组减轻。结论：OT上调胎鼠海马OTR、GABAARβ1表达，减少神经元变性坏死，增强大脑耐受缺氧损伤的能力，对胎儿中枢神经系统起保护作用。

【关键词】催产素;海马;缺氧无糖损伤;催产素受体;γ氨基丁酸A受体β1亚基

[Abstract]Objective：Tostudytheeffectsofoxytocin(OT)onchangesofoxytocinreceptor(OTR),gammaamimobutyricacidreceptorAβ1subunit(GABAARβ1)expressionsinfetusrathippocampusinducedbyoxygenandglucosedeprivation(OGD),andtoinvestigatethemechanismofneuroprotectiveeffectsofOT.Methods：Gestationalage20daysSDrathippocampusslicesintheexperimentalgroupunderwentpretreatmentincubationbycontaining10-6mol·L-1OTartificialcerebrospinalfluid(ACSF),thecontrolgroupwereincubatedwithnormalACSF.Oxygenandglucosedeprivation(OGD)wasdonefor15min,respectively.SPimmunohistochemistryandsemiquantitativetechniqueweretakentodeterminehippocampusCA1areaOTR,GABAARβ1expressions,andobserveneuronaldamageinelectronmicroscopy.Results:TheexpressionsofOTR,GABAARβ1inCA1areaofhippocampusweresignificantlyhigherintheexperimentalqroup(t=,P=;t=,P=).Alargenumberofdamagedneurons,nuclearcondensationorfragmentation,someofthenuclearmembranedissolvedinthecontrolgroup;whilenuclei,roughendoplasmicreticulum,mitochondriawereimproved,nuclearmembranewassmooth,cytoplasmicswellingwereeasedintheexperimentalgroup.Conclusion:OTcanincreasehippocampalOTR,GABAARβ1expressions,decreaseneuronaldegenerationandnecrosis,enhancethecapacityofthebraintolerancetohypoxia,andplaytheprotectiveeffectsonfetalnervoussystem.

[Keywords]oxytocin;hippocampus;oxygenandglucosedeprivation;oxytocinreceptor;gammaamimobutyricacidreceptorAβ1subunit

新生儿缺氧缺血性脑病(hypoxicischemicencephalopathy,HIE)是围产期缺氧、窒息导致脑的缺氧缺血性损害，临床出现一系列中枢神经系统异常表现的疾病，是引起新生儿死亡的主要原因之一，也是引起婴幼儿神经系统后遗症状的重要原因。各家报道HIE的死亡率和致残率仍为10%～30%。范晓梅[1]在对12000名活产儿进行调查中发现，HIE的发病率为1%，其中以胎儿窘迫为主要病因，占HIE发病的%。大脑被剥夺氧和葡萄糖后可引起神经元损伤和死亡，当神经和神经胶质细胞处在发育时期，这种损伤就更为严重。催产素(oxytocin,OT)是一种古老的内分泌激素，早期对OT的研究多侧重于其在分娩发动、乳汁分泌等方面的作用，近年来学者逐渐重视OT与神经精神系统发育的相关性研究。本实验室曾报道OT对孕晚期胎鼠海马缺氧无糖损伤(oxygenandglucosedeprivation，OGD)有神经保护作用，其机制可能与γ氨基丁酸(GABA)有关。现进一步围绕OT对OGD胎鼠海马催产素受体(oxytocinreceptor,OTR)、γ氨基丁酸A受体β1亚基(gammaamimobutyricacidreceptorAβ1subunit，GABAARβ1)表达的影响，探讨OT在胎儿神经保护方面的作用机制。

1材料与方法

动物及材料

实验动物孕龄20dSD大鼠4只，体重500～800g，由南京市江宁区青龙山动物繁殖场提供。

试剂及器材人工脑脊液(artificialcerebrospinalfluid，ACSF)成分(mmol·L-1)：葡萄糖、NaCl、KCl、NaH2PO4、MgSO4、NaHCO3、CaCl2;通入95%O2+5%CO2混合气体至少30min达到饱和，流量约为200ml·min-1，HCl调至pH～。缺氧无糖人工脑脊液(artificialcerebrospinalfluid/oxygenandglucosedeprivation,ACSF/OGD)：将混合气体95%O2+5%CO2换为95%N2+5%CO2，并且将ACSF中的葡萄糖换为同浓度的蔗糖。OT(上海第一生化药业)，OTR兔抗大鼠多克隆抗体(武汉博士德)，GABAARβ1兔抗大鼠多克隆抗体(Bioworld公司);SP免疫组化试剂盒(北京四正柏生物公司);数显恒流泵(上海沪西分析仪器厂);混合气体95%O2+5%CO2、95%N2+5%CO2(南京特种气体)。

方法

离体海马脑片制备孕鼠乙醚吸入麻醉，2%碘酒及75%乙醇消毒腹部剖腹取出胚胎，剥除胎盘完全暴露胎鼠，断头取脑后置于0～4℃ACSF中降温1min。用刀片冠状面切割全脑制作1～2mm脑片，保留包含海马的脑片，共得包括海马区脑片40片。将脑片转移至温度为(±)℃的ACSF中，不断通入95%O2+5%CO2混合气体，流量为200ml·min-1，孵育2～3h备用。

实验分组和给药方法实验用海马脑片共40片，对照组和实验组各20片。对照组用正常ACSF孵育2h，待其充分作用后通入ACSF/OGD，行OGD15min。实验组则将正常ACSF换成含10-6mmol·L-1OT的ACSF孵育，余同对照组。

评价

苏木素伊红染色海马脑片经4%甲醛固定后，24h内常规石蜡包埋切片，苏木素伊红染色制片。切片光学显微镜40×10倍视野下观察海马组织CA1区神经元排列、细胞形态变化及细胞核情况。

SP免疫组化法半定量检测海马脑片CA1区OTR、GABAARβ1表达具体操作按照试剂盒说明书。SP法即链霉素抗生素蛋白过氧化物酶连接法。石蜡切片依次经过二甲苯脱蜡、抗原修复后，行一抗+生物素标记二抗+辣根酶标记链酶卵白素+辣根酶底物DAB显色。免疫组化染色阳性反应为细胞膜呈黄棕色。每张切片光镜20×10倍下定位海马CA1区，然后40×10倍下用ImageProPlus图像分析软件测量CA1区阳性细胞的平均光密度值，分析OTR、GABAARβ1的表达。

透射电镜观察每组胎鼠各取2只,断头后立即取大鼠左侧海马组织2mm×2mm×5mm,固定于3%戊二醛，1%锇酸双固定，Epon812树脂包埋,超薄切片机切片,醋酸双氧铀柠檬酸铅双重染色,透射电子显微镜观察。电镜下观察神经元、胶质细胞等超微结构改变。

统计学处理

用SPSS统计软件包进行统计学分析。实验数据以均数±标准差表示,采用组间t检验及方差分析作统计学显着性检验。

2结果

苏木素伊红染色结果比较

光学显微镜下，细胞核呈深蓝色，胞浆呈淡红色。实验组脑片中可见海马CA1区锥体细胞呈多层排列，结构清晰,细胞排列较整齐紧密、分布亦较均匀,神经细胞数目多、外形规则,细胞层可分3～5层,胞核圆形或椭圆形,染色较淡,染色质均匀,偶见核深染或固缩,核膜边界清晰,核仁圆且明显。对照组脑片中可见海马CA1区神经细胞层次变少,数量减少,排列紊乱、稀疏。部分神经细胞核深染、固缩，核仁不明显，细胞周围间隙增大。见图1、2。

免疫组织化学染色结果比较

OT对胎鼠海马脑片CA1区OTR表达的影响实验组与对照组胎鼠海马脑片CA1区OTR免疫组织化学染色均有阳性反应，分别行平均光密度值测定，实验组OTR表达的平均光密度值为(±)，与对照组(±)比较显着升高(P=)，差异有统计学意义，见表1。表1海马脑片CA1区OTR表达平均光密度值比较

OT对胎鼠海马脑片CA1区GABAARβ1表达的影响实验组与对照组胎鼠海马脑片CA1区GABAARβ1免疫组织化学染色均有阳性反应，分别行平均光密度值测定，实验组GABAARβ1表达的平均光密度值为(±)，与对照组(±)比较显着升高(P=)，差异有统计学意义，见表2。表2海马脑片CA1区GABAARβ1表达平均光密度值比较

电镜观察海马神经细胞的损伤情况

对照组大量神经元受损、变性、坏死,核固缩或碎裂，部分核膜溶解,染色质呈团块状凝集,核仁碎裂，胞质内细胞器明显减少导致电子密度变低。其中细胞核超微结构改变见图3。

实验组细胞核、粗面内质网、线粒体均较对照组有所改善,核膜较光滑,染色质细小而分散,胞浆肿胀较对照组减轻,可见较多的细胞器。亦可见核膜皱褶内陷,核固缩,染色质凝集、边集等凋亡现象。其中细胞核超微结构改变见图4。

3讨论

胚胎中晚期及出生早期是海马神经元发育成熟的关键时期，海马结构中锥体细胞的产生、迁移、定位等均于胚胎时期完成。由于中枢神经系统对氧具有高敏感性，发育中的神经元对氧的需求较高。分娩过程对胎脑来说是具有高损伤风险的应激性事件，而这种应激主要来自产前、产时宫缩形成的相对缺氧状态。因此,离体状态下研究OT对孕晚期胎鼠海马OGD是否有神经保护作用及作用机制具有重要意义。

OT及OTR系统

OT为9个氨基酸组成的多肽，在哺乳、分娩、应激等刺激下释放入血液循环。OTR是经典G蛋白偶联受体，当OT与OTR胞外区结合后，活化胞内区Gq亚单位后激活磷脂酶Cβ进而产生一系列的生理功能。本实验中经OT预处理的胎鼠海马脑片经OGD后，CA1区OTR较对照组显着升高，上调了OTR在细胞膜上的表达。

GABA及GABAR系统

在成熟的大脑中GABA是重要的抑制性神经递质，GABA通过与其受体(gammaaminobutyricacidreceptor,GABAR)结合而发挥作用。GABAAR在神经系统广泛分布，主要介导突触后抑制效应，其中β1亚基是受体主要激活位点。在未成熟神经元，GABA是主要的兴奋性神经递质，对胎儿期和新生儿期神经元发育至关重要。当GABA与GABAAR结合，配体门控氯离子通道开放，神经元胞膜对Cl-通透性增加，Cl-流出神经元，神经元产生去极化效应，激活电压依赖性Ca2+通道，从而使细胞内Ca2+浓度升高，对神经元的生长和分化发挥重要作用。研究发现分娩时主要来源于母体下丘脑的OT通过胎盘屏障和胎儿血脑屏障到达胎儿大脑，通过降低氯离子内向协同转运体(Na+K+2Cl-cotransporter1,NKCC1)的活性以减少Cl-的内源性转运，使得神经元内Cl-浓度下降。本实验中经OT预处理的胎鼠海马脑片经OGD后，CA1区GABAARβ1较对照组显着升高，上调了GABAARβ1在细胞膜上的表达。当GABA作用于GABAAR时，配体门控Cl-通道开放增加，Cl-顺浓度差内流增加，GABA效应由兴奋性向抑制性转化。

OT与OTR、GABAARβ1关系

缺血缺氧可直接导致海马细胞损伤、能量衰竭。脑血流和氧运输的减少启动潜在有害生化级联反应，包括葡萄糖氧化磷酸化中断，细胞内ATP迅速耗竭，乳酸堆积、细胞膜去极化、兴奋性氨基酸释放以及细胞内Na+、Ca2+、水、自由基堆积，从而导致细胞毒性水肿和细胞死亡。本实验海马脑片石蜡切片HE染色、电镜结果均提示，实验组细胞的变性坏死明显减少，OT对海马神经元起保护作用。

本实验研究结果显示，经OT预处理的胎鼠海马脑片OGD后与对照组比较，OT显着上调OTR、GABAARβ1表达。OT可能通过一系列的下游机制抑制NKCC1活性，降低神经元内Cl-浓度，Cl-顺浓度差内流增加，当GABA与GABAAR结合时，配体门控Cl-通道开放增加，GABA效应由兴奋性向抑制性转化，导致神经元去极化抑制，减少神经元的耗氧量，从而增强大脑耐受缺氧损伤的能力，减轻分娩中缺氧和低血糖等伤害事件对胎儿大脑的损伤，实现对胎儿神经系统的保护作用。

【参考文献】

[1]范晓梅.120例新生儿缺血缺氧性脑病的发病情况与临床分析[J].中国妇幼保健,2008,23(14):34963697.

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PUGLIESEAM,COPPIE,VO