口腔微生物分子生物学

口腔微生物分子生物学第一页，共七十七页，编辑于2023年，星期五第二页，共七十七页，编辑于2023年，星期五生命的主要遗传物质脱氧核糖核酸（DNA）第三页，共七十七页，编辑于2023年，星期五DNA结构的推衍Chargaff:T+C=A+G A=T G=CX线衍射：

DNA在两条链组成，相互平行第四页，共七十七页，编辑于2023年，星期五核酸的组成DNA RNA脱氧核糖 核糖腺嘌吟胞嘧啶 腺嘌呤胞嘧啶鸟嘌呤胸腺嘧啶 鸟嘌呤尿嘧啶双链 单链第五页，共七十七页，编辑于2023年，星期五第六页，共七十七页，编辑于2023年，星期五第七页，共七十七页，编辑于2023年，星期五DNA复制半保留复制第八页，共七十七页，编辑于2023年，星期五DNA复制半不连接复制由于DNA多聚酶只能从5’→

3’方向合成DNA，因而半保留复制不能完全解释。第九页，共七十七页，编辑于2023年，星期五第十页，共七十七页，编辑于2023年，星期五DNA复制的特点新合成的子代DNA与亲代DNA完全一样，保证了遗传的稳定性。第十一页，共七十七页，编辑于2023年，星期五RNA信使RNA（mRNA)核蛋白体RNA（rRNA)转运RNA（tRNA)第十二页，共七十七页，编辑于2023年，星期五RNA的生物合成——转录以DNA为模板合与RNA由RNA多聚酶合成从DNA上特定起始序列（启动子）开始，至终止信号结束第十三页，共七十七页，编辑于2023年，星期五第十四页，共七十七页，编辑于2023年，星期五蛋白质的生物合成——翻译遗传密码

由3个连续的核苷酸组成第十五页，共七十七页，编辑于2023年，星期五蛋白质的生物合成——翻译蛋白质合成过程Ⅰ.氨基酸活化Ⅱ.蛋白质合成的起始AUG→甲酰化甲硫氨酸（fMet)Ⅲ.蛋白质合成的终止终止码UAA、UGA、UAG第十六页，共七十七页，编辑于2023年，星期五第十七页，共七十七页，编辑于2023年，星期五第十八页，共七十七页，编辑于2023年，星期五第十九页，共七十七页，编辑于2023年，星期五第二十页，共七十七页，编辑于2023年，星期五蛋白质的生物合成——翻译新生多肽的加工Ⅰ.fMet水解Ⅱ.磷酸化、糖基化、甲基化修饰Ⅲ.信号肽蛋白质向细胞外分泌第二十一页，共七十七页，编辑于2023年，星期五基因表达DNA→RNA→蛋白质丰富的生命现象第二十二页，共七十七页，编辑于2023年，星期五基因表达的调节机体的每一个细胞都有一套完全相同的基因共同表达的基因特异性表达的基因第二十三页，共七十七页，编辑于2023年，星期五第二十四页，共七十七页，编辑于2023年，星期五基因表达的调节共同表达的基因维持细胞基本结构、功能第二十五页，共七十七页，编辑于2023年，星期五基因表达的调节特异性表达的基因红细胞产生血红蛋白B淋巴细胞产生抗体成牙本质细胞分泌牙本质蛋白第二十六页，共七十七页，编辑于2023年，星期五基因表达调控的原因动力细胞内、细胞间，或细胞与外界环境间关系的变化。第二十七页，共七十七页，编辑于2023年，星期五基因表达调节的方式启动子强启动子与RNA多聚酶有较强的结合能力，转录水平较高；弱启动子则反之。第二十八页，共七十七页，编辑于2023年，星期五基因表达调节的方式调节蛋白的作用—负向调节—正向调节第二十九页，共七十七页，编辑于2023年，星期五负向调节乳糖操纵子学说第三十页，共七十七页，编辑于2023年，星期五第三十一页，共七十七页，编辑于2023年，星期五第三十二页，共七十七页，编辑于2023年，星期五正向调节第三十三页，共七十七页，编辑于2023年，星期五原核生物基因表达的调节主要在转录水平第三十四页，共七十七页，编辑于2023年，星期五真核基因生物调节多层次复杂性第三十五页，共七十七页，编辑于2023年，星期五分子克隆技术第三十六页，共七十七页，编辑于2023年，星期五限制性内切酶特定的识别序列，4~6个碱基对在识别序列内固定位置切割，5’–端磷酸基因，

3’-端羟基基团切割后形成粘性或平滑末端第三十七页，共七十七页，编辑于2023年，星期五第三十八页，共七十七页，编辑于2023年，星期五DNA连接酶催化DNA中相邻3’羟基和5’磷酸基团之间形成3’，5’–磷酸二酯键。第三十九页，共七十七页，编辑于2023年，星期五质粒细胞内独立于染色体外的环状DNA，能自我复制其上基因可借助宿主细胞的转录、翻译系统得以表达分子2000~50000bp第四十页，共七十七页，编辑于2023年，星期五TpGEM-TVector(3003bp)AmprlacZoriXmnI1994ScaI1875NaeI2695ApaIAatIISphIBstZINcoISacIIT7SpeINotIBstZIPstISaLINdeISacIBstXINsiISP6T1start14202631374655626273758294103112126

pGEM-Tvectormap第四十一页，共七十七页，编辑于2023年，星期五XhoISmaIXhoISmaIXhoISmaIpCIpCIA-PpGEM-T/A-P

A-PfragmentSub-cloningconstructionofrecombinantpCIA-PinsertionofA-PDNAfragmentintoplasmidpCIXhoISmaIT4LigaseA-Pfragment第四十二页，共七十七页，编辑于2023年，星期五构建质粒的特点Ori区：复制起点Par区：保证质粒均匀分布于子细胞多克隆区：人为构建，便于克隆操作选择因子：含特定基因，如耐抗生素基因，使克隆后便于挑选第四十三页，共七十七页，编辑于2023年，星期五接合在适当的条件下，雄性菌和雌性菌混合时形成配对的雄性-雌性菌，并有遗传物质的单向转移。雄性菌：含F性因子，染色体外环状DNA第四十四页，共七十七页，编辑于2023年，星期五第四十五页，共七十七页，编辑于2023年，星期五转化外源DNA能进入细胞内并通过整合至宿主DNA中或独立复制保存于宿主细胞内。第四十六页，共七十七页，编辑于2023年，星期五转录利用噬菌体为媒介，将供体DNA转移到受体菌内的现象，能在自然状态下发生。第四十七页，共七十七页，编辑于2023年，星期五第四十八页，共七十七页，编辑于2023年，星期五分子克隆常用技术DNA电泳基因转移核酸杂交聚合酶链反应PCR第四十九页，共七十七页，编辑于2023年，星期五DNA电泳可分离不同分子量的DNA第五十页，共七十七页，编辑于2023年，星期五第五十一页，共七十七页，编辑于2023年，星期五

Ladder1234567891011121314Ladder对临床菌株的第二次PCR扩增产物电泳图谱分析

Lane1~7:临床菌株S.sobrinus;Lane8~14:临床菌株S.mutans.(Kb)2.01.00.250.10.750.5MW第五十二页，共七十七页，编辑于2023年，星期五核酸杂交原理：在一定条件下（温度、pH值等）DNA双股螺旋可解开并分离在一定条件下，两股游离的互补的核苷酸可自行配对形成双股第五十三页，共七十七页，编辑于2023年，星期五SouthernBlot电泳、转移、杂交确定分子量第五十四页，共七十七页，编辑于2023年，星期五第五十五页，共七十七页，编辑于2023年，星期五第五十六页，共七十七页，编辑于2023年，星期五斑点杂交目标序列的存在目标序列的量第五十七页，共七十七页，编辑于2023年，星期五聚合酶链反应PCR第五十八页，共七十七页，编辑于2023年，星期五与龋病相关微生物的定量检测方法细菌形态生化反应免疫反应分子生物学方法----分子探针杂交----RFLP----PCR唾液在与龋病相关微生物检测中的应用第五十九页，共七十七页，编辑于2023年，星期五在人类口腔中检出率很高茸毛链球菌可能比变形链球菌与龋损活跃性之间的关系更密切变形链球菌和茸毛链球菌唾液在与龋病相关微生物检测中的应用第六十页，共七十七页，编辑于2023年，星期五套式PCR快速检测人类唾液中变形链球菌和茸毛链球菌.谭海平，边专，樊明文，陈智，范兵.中华口腔医学杂志，2003，38：223-226唾液在与龋病相关微生物检测中的应用第六十一页，共七十七页，编辑于2023年，星期五套式PCR(NestedPCR)5′

3′

TemplateOuterprimer2Outerprimer1ThefirstPCR5′

3′

Interprimer2Interprimer1NexttemplateThesecondPCR5′

3′

ThesecondPCRproduct第六十二页，共七十七页，编辑于2023年，星期五本套式PCR的引物是分别根据变形链球菌gtfB基因和茸毛链球菌gtfI基因设计的内、外两套引物（outerprimer,interprimer）gtfBgeneofS.mutansOuterprimerthp4Outerprimerthp3ThefirstPCRInterprimerthp8Interprimerthp7Outerprimerthp6gtfIgeneofS.sobrinusOuterprimerthp5ThefirstPCRInterprimerthp10Interprimerthp9ThesecondPCRThesecondPCR

第六十三页，共七十七页，编辑于2023年，星期五抽提细菌染色体DNA(Igarashietal.1996)----细菌----唾液PCR反应过程第一次PCR反应

预变性:94℃4min

变性:94℃1min

退火:51℃1min30cycles

延伸:72℃2min

最后延伸:72℃5min

第二次PCR反应第六十四页，共七十七页，编辑于2023年，星期五

abcdefghLadder12345678选择外引物行第一次PCR后扩增产物电泳图谱分析以变链菌组(MutansStreptococci)染色体DNA为模板

Lane1:S.cricetusAHT;2.S.rattusBHT;3.S.mutansIngbritt;4.S.sobrinusOMZ176;5.S.mutansLM-7;6.S.mutansOMZ175;7.S.sobrinus6715;8.S.downeiMfe28.

MW(Kb)2.01.00.250.10.750.5第六十五页，共七十七页，编辑于2023年，星期五

abcdefghLadder12345678选择内引物行第二次PCR后扩增产物电泳图谱分析

Lane1:S.cricetusAHT;2.S.rattusBHT;3.S.mutansIngbritt;4.S.sobrinusOMZ176;5.S.mutansLM-7:6.S.mutansOMZ175;7.S.sobrinus6715;8.S.downeiMfe28.Marker:DL2,000Ladder

MW(Kb)2.00.750.51.00.250.1第六十六页，共七十七页，编辑于2023年，星期五

Ladder123456第一次PCR的灵敏度

变形链球菌S.mutansIngbritt的数量

Lane1:108CFU;Lane2:107CFU;Lane3:106CFU;Lane4:105CFUMW(Kb)2.00.750.51.00.25第六十七页，共七十七页，编辑于2023年，星期五

2.0

0.5

Ladder1234561.00.750.25MW(Kb)第二次PCR的灵敏度

变形链球菌S.mutansIngbritt的数量

Lane1:104CFU,Lane2:103CFU

第六十八页，共七十七页，编辑于2023年，星期五

Ladder1234567891011121314Ladder对临床菌株的第二次PCR扩增产物电泳图谱分析

Lane1~7:临床菌株S.sobrinus;Lane8~14:临床菌株S.mutans.(Kb)2.01.00.250.10.750.5MW第六十九页，共七十七页，编辑于2023年，星期五

Ladder12345LadderMW1.0(Kb)0.750.50.250.1