发酵条件及过程控制

发酵条件及过程控制第一页，共一百零九页，编辑于2023年，星期五本章主要内容第一节营养基质和菌体浓度的影响及控制第二节温度的影响及其控制第三节pH的影响及控制第四节溶氧的影响及控制第五节泡沫的影响及控制第六节二氧化碳和呼吸商第七节发酵终点的控制第八节发酵过程的控制第二页，共一百零九页，编辑于2023年，星期五本章主要内容第一节营养基质和菌体浓度的影响及控制第二节温度的影响及其控制第三节pH的影响及控制第四节溶氧的影响及控制第五节泡沫的影响及控制第六节二氧化碳和呼吸商第七节发酵终点的控制第八节发酵过程的控制第三页，共一百零九页，编辑于2023年，星期五第一节营养基质和菌体浓度的影响及控制（一）碳源

1、碳源的种类的影响迟效碳源种类：淀粉、乳糖、蔗糖、麦芽糖、玉米油优点：不易产生分解产物阻遏效应；有利于延长次级代谢产物的分泌期缺点：溶解度低，发酵液粘度大。速效碳源种类：葡萄糖优点：吸收快，利用快，能迅速参加代谢合成菌体和产生能量缺点：有的分解代谢产物对产物的合成会产生阻遏作用。糖对青霉素生物合成的影响第四页，共一百零九页，编辑于2023年，星期五2、碳源的浓度影响发酵过程举例（1）碳分解代谢物阻遏：在某一浓度下碳源会阻遏一个或多负责产物合成的酶。克服该效应一种方法是采用中间补料的方式使补入碳源的速率等于其消耗速率；另一种方法是使用非阻遏性碳源。（2）过高浓度对菌体生长的影响：在重组毕赤酵母发酵生产水蛭素过程中，甲醇既作为碳骨架，使细胞生长，又作为诱导物可以提高产物表达，但甲醇浓度的提高会抑制细胞生长甚至导致细胞死亡。因此，利用甲醇传感器控制甲醇流量，同时以限制性速度混合流加甘油，可获得较高的水蛭素产量。（3）yeastCrabtreeeffect：即酵母生长在高糖浓度下，即使溶氧充足，它还会进行厌氧发酵，从葡萄糖生产乙醇。因此，一般采用补料分批或连续培养方式来避免crabtree效应。第五页，共一百零九页，编辑于2023年，星期五yeastCrabtreeeffectdescribesthephenomenonwherebytheyeast,Saccharomycescerevisiae,producesethanol(alcohol)aerobicallyinthepresenceofhighexternalglucoseconcentrationsratherthanproducingbiomassviathetricarboxylicacidcycle,theusualprocessoccurringaerobicallyinmostyeastse.g.Kluyveromycesspp.Increasingconcentrationsofglucoseacceleratesglycolysis(thebreakdownofglucose)whichresultsintheproductionofappreciableamountsofATPthroughsubstrate-levelphosphorylation.ThisreducestheneedofoxidativephosphorylationdonebytheTCAcycleviatheelectrontransportchainandthereforedecreasesoxygenconsumption.Thephenomenonisbelievedtohaveevolvedasacompetitionmechanism(duetotheantisepticnatureofethanol)aroundthetimewhenthefirstfruitsonEarthfellfromthetrees.HereisthedetailofyeastCrabtreeeffect第六页，共一百零九页，编辑于2023年，星期五（二）氮源1、氮源的种类无机氮源和有机氮源：发酵工业中常用的无机氮源包括硝酸盐、铵盐、氨水等；有机氮源包括豆饼粉、花生饼粉、蛋白胨、酵母粉、酒糟、尿素等。无机氮源或以蛋白质降解产物形式存在的有机氮源可以直接被菌体吸收利用，这种氮源叫做速效氮源，反之为迟效氮源。前者包括氨基态氮的氨基酸或者铵盐形式的硫酸铵和玉米浆等，后者包括黄豆饼粉、花生饼粉、棉籽饼粉等。速效氮源易于被菌体吸收利用，所以有利于菌体生长，却会影响某些产物的的产量；迟效氮源对延长次级代谢产物的分泌期、提高产物产量有好处，但一次性投入容易使养分过早耗竭，导致菌体过早衰老自溶，从而缩短产物分泌期。因此，发酵培养基一般选用含有速效迟效氮源的混合氮源。对某些发酵过程来说，培养基中某些氮源的添加有利于该发酵过程中产物的积累，这些主要是培养基中的有机氮源作为菌体生长繁殖的营养外，还有作为产物的前体。无机氮源利用会快于有机氮源，但是常会引pH值的变化，这必须注意随时调整。

第七页，共一百零九页，编辑于2023年，星期五2、氮源的浓度氮源浓度过高，会导致细胞脱水死亡，且影响传质；浓度过低，菌体营养不足，影响产量。影响发酵的方向：谷氨酸发酵——NH4+供应不足,促使形成α-酮戊二酸；NH4+过量,促使谷氨酸转变成谷氨酰胺，所以要控制适量的NH4+浓度。为调节菌体生长和防止菌体衰老自溶，可根据需要随时补加有机和无机氮源。第八页，共一百零九页，编辑于2023年，星期五（三）磷酸盐浓度的影响及控制基础培养基中采用适量的浓度给予控制，以保证菌体的正常生长所需；

代谢缓慢：补加磷酸盐。举例：在四环素发酵中,间歇,微量添加磷酸二氢钾,有利于提高四环素的产量。微生物生长良好时，所允许的磷酸盐浓度为0.32～300mmol/L，但次级代谢产物合成良好时所允许的磷酸盐最高水平浓度仅为1mmol/L。因此，在许多抗生素，如链霉素、新霉素、四环素、土霉素、金霉素和万古霉素等的合成中要以亚适量添加。

举例：四环素发酵：菌体生长最适的磷浓度为65～70μg/mL,而四环素合成最适磷浓度为25～30μg/mL。第九页，共一百零九页，编辑于2023年，星期五（四）菌体浓度的影响及控制1、菌体浓度（cellconcentration）指单位体积中菌体的含量，是发酵工业中的一个重要参数。它不仅代表菌体细胞的多少，而且反应菌体细胞生理特性不完全相同的分化阶段。在发酵动力学研究中，常采用菌体浓度来计算菌体的比生长速率和产物的比生产速率等动力学参数及相互关系。菌体浓度的检测浊度法：用于非丝状菌的浓度测定。通常测定420-600nm波长范围内的光密度值（OD）。吸光度要求控制在0.3-0.5。干重法：取一定体积的发酵液离心或过滤，105℃烘至恒重称重。离心称湿重法：取一定体积的发酵液离心或过滤，自然沉降或离心，测定湿重。第十页，共一百零九页，编辑于2023年，星期五2、影响菌体生长速率的因素：菌体生长速率与微生物的种类和自身的遗传特性相关；如：典型的细菌，酵母，霉菌和原生动物的倍增时间分别为45min，90min，3h和6h左右，这说明各类微生物增殖速率的差异。取决于营养物质的种类和浓度，基质浓度与比生长率的关系如右图所示。如：各种碳源和氮源等成分和它们的浓度。上限浓度，基质抑制(渗透压，关键酶，代谢废物)。一些营养物质的上限浓度(g/L)如下：葡萄糖100，NH4+5，PO43-10。有影响的环境条件有温度,pH值,渗透压和水分活度等因素。第十一页，共一百零九页，编辑于2023年，星期五3、菌体浓度对产物的影响在适当的比生长速率下，发酵产物的产率与菌浓成正比关系,即

P=QPmc(X)。式中，P——发酵产物的产率(产物最大生成速率或生率),g/(L·h);QPm——产物最大比生成速率,h-1;c(X)——菌体浓度,g/L.初级代谢产物的产率与菌体浓度成正比；而次级代谢产物的生产中，控制菌体的比生长速率μ比μ临略高一点的水平，即c(X)

≤c(X)临时，菌体浓度越大，产物的产量才越大。c(X)过高，摄氧率增加，溶氧成为限制因素，使产量降低。第十二页，共一百零九页，编辑于2023年，星期五控制接种量：接种量指种子液体积和培养液体积之比。一般发酵常用接种量5%～10%；抗生素的接种量有时可增至20%～25%，甚至更大。基质含量：营养的配比和中间补料的方式。生长速率取决于基质的浓度，在微生物发酵的研究和控制中，营养条件（含溶氧）的控制至关重要，主要受基质浓度的影响，所以要依靠调节培养基的浓度来控制菌浓。4、发酵中菌体浓度的控制为了获得抗生素最高的生产率，需要采用摄氧速率OUR与传氧速率OTR相平衡时的菌体浓度，也就是传氧速率随菌浓变化的曲线和摄氧速率随菌浓变化的曲线的交点所对应的菌体浓度，即临界菌体浓度c(X)临。第十三页，共一百零九页，编辑于2023年，星期五本章主要内容第一节营养基质和菌体浓度的影响及控制第二节温度的影响及其控制第三节pH的影响及控制第四节溶氧的影响及控制第五节泡沫的影响及控制第六节二氧化碳和呼吸商第七节发酵终点的控制第八节发酵过程的控制第十四页，共一百零九页，编辑于2023年，星期五第二节温度对发酵的影响及控制微生物的生长和产物的合成都是在各种酶催化下进行的，温度是保证酶活性的重要条件，因此在发酵系统中必须保证稳定而合适的温度环境。通常在生物学范围内每升高10℃，生长速度就加快一倍，温度直接影响其生长。机体的重要组成如蛋白质、核酸等都对温度较敏感，随着温度的增高有可能遭受不可逆的破坏。微生物可生长的温度范围较广，总体说在-10～95℃。第十五页，共一百零九页，编辑于2023年，星期五1、温度对发酵的影响

（1）温度对微生物生长的影响大多数微生物在20-40℃的温度范围内生长。嗜冷菌在温度低于20℃下生长速率最大，嗜中温菌在30-35℃左右生长，嗜热菌在50℃以上生长。第十六页，共一百零九页，编辑于2023年，星期五（2）温度对发酵过程的影响温度对青霉菌生长速率、呼吸强度和青霉素生产速率的影响如上图所示。可以看出，温度对参与生长繁殖、呼吸和青霉素形成的速率影响是不同的。温度对青霉菌生长速率的影响温度对青霉菌呼吸强度的影响温度对青霉素生产速率的影响温度对青霉菌生长速率的影响温度对青霉菌呼吸强度的影响温度对青霉素生产速率的影响第十七页，共一百零九页，编辑于2023年，星期五（3）温度对发酵液物理性质的影响＃影响氧在发酵液中的溶解度温度↑溶氧↓＃影响基质的分解和吸收速率如：菌体对硫酸盐吸收在25℃时最小。（4）温度对生物合成方向的影响金色链霉菌四环素发酵中所用的金色链霉菌，其发酵过程中能产生金霉素和四环素。低于30℃时，合成金霉素能力强，合成四环素能力随温度升高而增加；当达到35℃时，只产生四环素。第十八页，共一百零九页，编辑于2023年，星期五（5）温度对微生物代谢调节的影响温度与微生物的代谢调节机制关系密切

例如：在低温（20℃）时，氨基酸末端产物对其合成途径的第一个酶的反馈抑制作用，比在其正常生长温度37℃时更大。因此，考虑在抗生素发酵的后期降低温度，加强氨基酸的反馈抑制作用，使蛋白质和核酸的正常合成途径关闭得早些，从而使发酵代谢转向抗生素的合成。微生物的酶的组成和特性也受到温度的控制

例如：用米曲霉制曲时，温度控制在低限，有利于蛋白酶的合成，α-淀粉酶的活性受到抑制。第十九页，共一百零九页，编辑于2023年，星期五2、影响发酵温度的因素发酵热：指的是发酵过程中释放出来的净热量，以J/(m3·h)为单位表示。发酵热的通式可表示为：

Q发酵=Q生物+Q搅拌-Q蒸发±Q辐射（1）生物热（Q生物）：指微生物在生长繁殖中，培养基质中的碳水化合物、脂肪和蛋白质被氧化分解为二氧化碳、水和其他物质时释放出的热。这些释放出来的能量一部分用于合成和代谢活动，另一部分用于合成代谢产物，其余部分则以热的形式散失。发酵过程中的生物热与菌株和培养基成分相关，菌种在营养丰富的培养基中因代谢活力较强，所以生物热要高于在营养一般的培养基中；在呼吸作用和发酵作用较强的对数生长期，所产生的热量要高于发酵初期的延滞期和发酵后期的衰亡期。第二十页，共一百零九页，编辑于2023年，星期五（2）搅拌热（Q搅拌）：指在机械搅拌通气发酵罐中，由于机械搅拌带动发酵液作机械运动，造成液体之间、液体与搅拌器等设备之间的摩擦而产生的热。搅拌热与搅拌轴的功率有关，计算公式为：

Q搅拌=P×3601(kJ/h)

式中，P——搅拌功率，kW；

3601——机械能转变为热能的热功当量，kJ/(kW•h)。第二十一页，共一百零九页，编辑于2023年，星期五（3）蒸发热（Q蒸发）：指发酵过程中通气时，引起发酵液水分的蒸发，被空气和水分带走的热量，也叫汽化热。这部分热量在发酵过程中先以蒸汽形式散发到发酵罐的液面，再由排气管带走。可按下式计算：

Q蒸发=qm（H出-H进）式中，qm——干空气的质量流量，kg/h；

H出、H进——发酵罐排气、进气的热焓，kg/h。（4）辐射热（Q辐射）：指由于发酵罐液体温度与罐外环境温度不同，发酵液中部分热向外辐射或由外界向发酵液辐射所产生的热。辐射热的大小取决于罐内外温度差。第二十二页，共一百零九页，编辑于2023年，星期五（5）发酵热（Q发酵）发酵热的计算：①通过测量一定时间内冷却水的流量和冷却水进出口温度来计算：

Q发酵=qvc（t2-t1）/V

式中，qv——冷却水的体积流量，L/h；

c——水的比热容，kJ/(kg•℃)；

t2，t1——进、出冷却水的温度；

V——发酵液体积，m3。②通过罐温度的自动控制，先使罐温达到恒定，再关闭自动装置，测量温度随时间上升的速率，按下式求出发酵热：

Q发酵=（M1c1+M2c2）u

式中，M1——发酵液的质量，kg；

M2——发酵罐的质量，kg；

c1——发酵液的比热容，kJ/(kg•℃)；

c2——发酵罐材料的比热容，kJ/(kg•℃)；

u——温度上升速率，℃/h。第二十三页，共一百零九页，编辑于2023年，星期五3、发酵过程温度的控制发酵热在整个发酵过程中是随时间变化的。所以，为使发酵在一定温度下进行，必须采取措施——在夹套或蛇管内通入冷水加以控制；小型的发酵罐，在冬季和发酵初期，散热量大于产热量则需用热水保温。最适菌体生长温度和最适产物合成温度有时存在差异，因此可分为两个阶段分别控制温度。温度选择还需参考其他条件，如培养基特性和通风条件。通过计算机模拟发酵条件，结合实验和实际生产过程研究特定发酵过程随温度的变化的规律性，可有效提高产量。第二十四页，共一百零九页，编辑于2023年，星期五本章主要内容第一节营养基质和菌体浓度的影响及控制第二节温度的影响及其控制第三节pH的影响及控制第四节溶氧的影响及控制第五节泡沫的影响及控制第六节二氧化碳和呼吸商第七节发酵终点的控制第八节发酵过程的控制第二十五页，共一百零九页，编辑于2023年，星期五第三节pH的影响和控制不同种类微生物对pH的要求不同。大多数细菌的最适pH为6.5～7.5，霉菌一般是4.0～5.8，酵母菌为3.8～6.0，放线菌为6.5～8.0。pH是微生物生长和产物合成的重要参数，代谢活动的综合指标。控制一定的pH不仅是保证微生物正常生长的主要条件之一，还是防止杂菌污染的一个有效措施。对于同一种微生物由于生长环境的pH不同，也可能会形成不同的发酵产物。微生物菌体生长的最适pH值和产物合成的最适pH往往不一定相同，因此对发酵过程pH的控制十分重要。第二十六页，共一百零九页，编辑于2023年，星期五1、发酵液pH值对发酵的影响影响微生物细胞原生质膜的电荷状态：改变原生质膜的离子透性，影响营养物质的吸收和代谢产物的泄漏；影响酶的活性：酶需在最适的pH值环境中工作；某些酶的活性在某pH值下受到抑制是对产物的一种保护机制；影响菌体的形态：pH值还会影响某些霉菌的形态，如细胞壁厚度、菌丝直径。如：产黄青霉的细胞壁厚度随pH增加而减小；影响培养基中营养物质的解离，从而影响吸收。第二十七页，共一百零九页，编辑于2023年，星期五2、发酵过程中影响pH变化的因素（1）菌体对营养基质的吸收引起发酵液pH的改变：培养基pH在发酵过程中能被菌体代谢所改变。若阴离子(如PO43-

、NO3-)被吸收，则pH上升；阳离子(如NH4+

、K+)被吸收，使pH下降。（2）菌体的代谢产物会改变发酵液的pH：代谢产生有机酸，如乳酸、乙酸、柠檬酸等；或一些碱性物质。一般来说，高碳源培养基倾向于向酸性pH转移，高氮源培养基倾向于向碱性pH转移，这都跟碳氮比直接有关。第二十八页，共一百零九页，编辑于2023年，星期五3、发酵过程pH的控制方法（1）添加碳酸钙：生理酸性铵盐的利用引起pH的下降可用碳酸钙来中和，在乳酸发酵中防止乳酸产量的降低。（2）氨水流加法：价格便宜，来源容易；但作用快，对pH的影响波动大；高浓度的氨水引起pH的大幅上升，会导致呼吸强度急剧下降，引起微生物氨过量中毒。通过少量多次流加的方式进行。（3）尿素流加法：用尿素流加调节pH，易于操作，且pH变化具有一定的规律性，即由于通风、搅拌和菌体中脲酶作用使尿素分解放氨，pH上升；氨和培养基成分被菌体利用并形成有机酸等中间代谢物，pH又降低，下一轮尿素添加后又符合该规律。流加时除主要考虑pH变化外，还当考虑菌体生长、耗糖、发酵的不同阶段来调整添加的频率和量。（4）补料控制pH：通过调节加糖速率来控制pH，可比恒速加糖，酸碱控制pH提高青霉素产量25%以上。第二十九页，共一百零九页，编辑于2023年，星期五4、菌体生长与产物合成间pH值的相互关系μ：菌体的比生长速率Qp：产物比生产速率第三十页，共一百零九页，编辑于2023年，星期五表几种抗生素的最适pH发酵范围第三十一页，共一百零九页，编辑于2023年，星期五本章主要内容第一节营养基质和菌体浓度的影响及控制第二节温度的影响及其控制第三节pH的影响及控制第四节溶氧的影响及控制第五节泡沫的影响及控制第六节二氧化碳和呼吸商第七节发酵终点的控制第八节发酵过程的控制第三十二页，共一百零九页，编辑于2023年，星期五第四节溶氧的影响及控制氧是一种难溶于水的气体。在25℃，1×105Pa条件下，纯氧在水中的溶解度为1.26mmol/L，空气中的氧在纯水中的溶解度更低（0.25mmol/L）。如果考虑呼吸的化学计量，则葡萄糖的氧化可由下式表示：C6H12O6+6O2=6H2O+6CO2只有当这两种物质都溶于水中才能进行反应。但在28℃氧在发酵液中的溶解度只有0.22mmol/L（7mg/L，比糖的溶解度小7000倍），而发酵液中的大量微生物耗氧迅速（耗氧速率大于25-100mmol/L·h）。因此，供氧对于好氧微生物来说是非常重要。在好氧深层培养中，氧气的供应往往是发酵能否成功的重要限制因素之一。第三十三页，共一百零九页，编辑于2023年，星期五1、临界氧（C临）：指不影响微生物呼吸所需要的最低氧浓度。各种微生物的临界氧值以空气氧饱和度%来表示，也可用单位体积中的溶氧量表示（mmol/L）,这必须在同样的温度、罐压、通气搅拌下进行比较。第三十四页，共一百零九页，编辑于2023年，星期五2、溶氧对发酵的影响微生物的呼吸临界氧值不一定与产物合成临界氧值相同。溶氧浓度高于临界值，才能维持菌体的最大比摄氧率，得到最大的菌体合成量；低于临界值，菌体代谢受到干扰。但溶氧浓度高于或低于临界氧值都有可能刺激发酵产物的形成，这取决于发酵产物形成的过程。根据需氧不同，可将初级代谢发酵分为以下三类：①供氧充足条件下，产量最大；若供氧不足，合成受强烈抑制：如，谷氨酸、精氨酸、脯氨酸等；②供氧充足条件下，可得最高产量；若供氧受限，产量受影响不明显：如，异亮氨酸、赖氨酸、苏氨酸等；③若供氧受限，细胞呼吸受抑制时，才获得最大量产物；若供氧充足，产物形成反而受抑制：如，亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸等。第三十五页，共一百零九页，编辑于2023年，星期五黄色短杆菌（Brevibacteriumflavum）生物合成氨基酸的过程中溶解氧的影响研究第三十六页，共一百零九页，编辑于2023年，星期五但在实际过程中应该注意：控制溶氧浓度：溶解氧浓度过高（代谢异常，菌体提前自溶）；溶解氧浓度过低（代谢异常，产量降低）引起溶氧异常下降的可能原因：污染了好气性杂菌，大量的溶氧被消耗，可能在短时间内（一般2～5h内）使溶氧接近到零，并长时间不回升；菌体代谢发生异常现象，需氧量增加，使溶氧下降；某些设备或工艺控制发生故障或变化，如搅拌功率消耗变小或搅拌速度变慢，影响供氧能力，使溶氧降低。第三十七页，共一百零九页，编辑于2023年，星期五3、发酵过程溶氧的变化（1）发酵前期：由于微生物大量繁殖，需氧量不断大幅度增加，此时需氧超过供氧，溶氧明显下降；（2）发酵中后期：溶氧浓度明显受工艺控制手段的影响，如补料的数量、时机和方式等；（3）发酵后期：由于菌体衰老，呼吸减弱，溶氧浓度也会逐步上升，一旦菌体自溶，溶氧就会明显上升。第三十八页，共一百零九页，编辑于2023年，星期五4、影响氧溶解及传递的因素Ifonlysuspendedcellsareinvolvedandifthelevelofmixinginthebulkliquidissufficientlyhigh,thentheratelimitingstepintheoxygentransferprocessisthemovementoftheoxygenmoleculesthroughthebubbleboundarylayer.第三十九页，共一百零九页，编辑于2023年，星期五氧传递速率oxygentransferrateOTR=dC/dt=KLa(C*-CL)式中，dC/dt——单位时间内发酵液溶氧浓度的变化，mmolO2/(L·h)KL——氧传质系数，m/h；a——比表面积，m2/m3;C*——氧在水中的饱和浓度，mmol/L;CL——发酵液中氧浓度，mmol/L。因a所代表的单位体积的溶氧面面积无法估算，因此，将KLa合为一体来考量，代表的是单位体积中氧的传递速率。第四十页，共一百零九页，编辑于2023年，星期五（1）影响体积氧传递系数KLa的因素①搅拌：形成小气泡，增大比表面积液体涡流运动，增加气液接触时间料液湍流运动，促进传质使菌体分散，避免结团②空气流速（线速度）：空气线速度较小时，KLa随线速度增加而增加；空气线速度增加至一定程度后，如不改变搅拌速度，则会降低搅拌功率，使KLa降低，甚至发生“过载”现象第四十一页，共一百零九页，编辑于2023年，星期五③空气分布管：改变气泡大小，从而改变气泡的比表面积。④发酵罐内液柱的高度根据经验数据：

H/D从1增加到2，KLa增加40%；

H/D从2增加到3，KLa增加20%；第四十二页，共一百零九页，编辑于2023年，星期五⑤发酵液的性质发酵液粘度影响液体湍动性及液膜的阻力。⑥消泡剂消泡剂：降低氧的传递速率。消泡剂对氧传递的抑制作用第四十三页，共一百零九页，编辑于2023年，星期五（2）影响传质推动力(C*-CL)的因素①温度和氧分压根据亨利定律：C*=PO2/HO2式中，PO2——氧分压；

HO2——亨利常数，取决于温度和溶质浓度第四十四页，共一百零九页，编辑于2023年，星期五②溶液性质盐和糖的存在降低了氧的溶解度③发酵罐内液柱的高度提高氧分压的一个方法就是提高气泡总压力。如：将气泡的压力提高到10atm，则氧分压就可达2.1atm。直接提高罐压，会存在工程上的问题，因此可以通过提高液柱高度来解决。Pbase=ρgh+1atmosphere式中，Pbase：罐底部压力（Pa）

ρ：发酵液密度g：重力加速度（9.8m.s-2）h：液柱高度（m）第四十五页，共一百零九页，编辑于2023年，星期五发酵液中氧的供需平衡耗氧速率：γ(OUR)=QO2·X式中，γ——摄氧率，mmol/L；

QO2——呼吸强度，mmolO2/(g·h)；

X——菌浓度，g/L。溶氧DO平衡，OTR=OUR，即KLa(C*-CL)=QO2·X原则上发酵罐的供氧能力无论提得多高，若工艺条件不配合，仍然会出现供氧不足的现象。因此应适当控制菌的摄氧率。工艺方面有许多行之有效地措施，如控制加糖或补料速率、改变发酵温度、液化培养基、中间补水、添加表面活性剂等。只要这些措施运用得当，便能改善溶氧状况和维持合适的供氧水平。第四十六页，共一百零九页，编辑于2023年，星期五表影响需氧的工艺条件项目工艺条件项目工艺条件好气程度补料或加糖配方、方式、次数和时机菌种特性菌龄、数量温度恒温或阶段变温控制菌的聚集状态、絮状或小球状溶氧与尾气O2及CO2水平按生长或产物合成的临界值控制培养基性能基础培养基组成、配比消泡剂或油种类、数量、次数和时机物理性质：黏度、表面张力等表面活性剂第四十七页，共一百零九页，编辑于2023年，星期五溶氧控制的方法及比较第四十八页，共一百零九页，编辑于2023年，星期五本章主要内容第一节营养基质和菌体浓度的影响及控制第二节温度的影响及其控制第三节pH的影响及控制第四节溶氧的影响及控制第五节泡沫的影响及控制第六节二氧化碳和呼吸商第七节发酵终点的控制第八节发酵过程的控制第四十九页，共一百零九页，编辑于2023年，星期五第五节泡沫的影响及控制1、泡沫的性质泡沫是气体被分散在少量液体中的胶体体系。泡沫间被一层液膜隔开而彼此不相连通。发酵过程中所遇到的泡沫，其分散相是无菌空气和代谢气体，连续相是发酵液。2、泡沫的类型一类存在于发酵液的液面上，这类泡沫气相所占的比例特别大，并且泡沫与它下面的液体之间有能分辨的界线。如在某些稀薄的前期发酵液或种子培养液中所见到的。另一类泡沫是出现在粘稠的菌丝发酵液中，这种泡沫分散很细，而且很均匀，也较稳定。泡沫与液体间没有明显的界线，在鼓泡的发酵液中气体分散相占的比列由下而上逐渐增加。第五十页，共一百零九页，编辑于2023年，星期五3、泡沫产生的原因由外界引进的气流被机械地分散形成（通风、搅拌）发酵过程中产生的气体聚结生成（发泡性物质）4、泡沫对发酵的不利影响⑴泡沫的持久存在影响着微生物对氧的吸收，妨碍二氧化碳的排除，因而破坏其生理代谢的正常进行，不利于发酵。⑵使发酵液的装料系数减少。由于泡沫大量生成，致使培养液的容量一般只能等于种子罐容量的一半左右，大大影响了设备的利用率。⑶大量的泡沫易造成逃液，增加污染杂菌的机会，造成巨大损失。第五十一页，共一百零九页，编辑于2023年，星期五5、影响泡沫产生和稳定的因素（1）通气与搅拌的强度（2）培养基的配比及原材料的组成（3）培养基的破坏程度（4）接种量大小（5）培养液本身性质的变化（发酵过程）（6）培养基灭菌的方法和操作（7）染菌第五十二页，共一百零九页，编辑于2023年，星期五不同搅拌速度和通气量对泡沫的影响不同搅拌速度和通气量对泡沫的影响第五十三页，共一百零九页，编辑于2023年，星期五不同浓度蛋白质原料的起泡作用第五十四页，共一百零九页，编辑于2023年，星期五灭菌时间对泡沫稳定性的影响第五十五页，共一百零九页，编辑于2023年，星期五发酵过程泡沫的变化第五十六页，共一百零九页，编辑于2023年，星期五6、泡沫的检测和控制（1）物理消泡法：依靠机械的强烈振动，压力的变化，促使气泡破裂，或借机械力将排出气体中的液体加以分离和回收。罐内消泡法：借助耙式消泡桨罐外消泡法：旋转叶片罐外消泡优点：不需引入其他物质，减少污染机会；缺点：效果不够迅速可靠，不能从根本上消除引起泡沫稳定的因素。第五十七页，共一百零九页，编辑于2023年，星期五（2）化学消泡法：机理：消泡剂为表面活性剂，造成气泡膜局部机械强度降低，力的平衡受到破坏，在力的作用下气泡破裂、合并，最后导致泡沫破裂。常见消泡剂：天然油脂类玉米油、豆油、棉籽油、鱼油等高碳醇类十八醇、乙二醇聚合物聚醚类聚氧丙烯甘油、聚氧乙烯丙烯甘油硅酮类聚二甲基硅氧烷第五十八页，共一百零九页，编辑于2023年，星期五（3）消泡剂具体使用过程最简单的检测是定时在发酵罐视孔上观察泡沫产生情况，发现泡沫持续上升时，开启消泡剂贮罐的阀门，流加少量消泡剂，使泡沫消失即可。也可在罐内顶部装液位仪与控制仪表连结，用以控制消泡贮率阀门的开启。当泡沫上升接触探头顶端时产生的信号，通过控制装置，指令打开泵开关或阀门，自动加入消泡剂，泡沫消失，信号也随之消失，阀门关闭。第五十九页，共一百零九页，编辑于2023年，星期五本章主要内容第一节营养基质和菌体浓度的影响及控制第二节温度的影响及其控制第三节pH的影响及控制第四节溶氧的影响及控制第五节泡沫的影响及控制第六节二氧化碳和呼吸商第七节发酵终点的控制第八节发酵过程的控制第六十页，共一百零九页，编辑于2023年，星期五第六节二氧化碳和呼吸商1、CO2是微生物的代谢产物，同时也是某些合成代谢的基质。它是细胞代谢的重要指标。二氧化碳微生物的代谢产物,合成产物的一种基质反映微生物生长和发酵状况,可通过碳质量平衡来估算菌体生长速率和细胞量。2、CO2对菌体生长和产物形成的影响在发酵过程中，CO2有可能对发酵有促进作用，也有可能有抑制作用。（1）对发酵促进：某些无机化能营养菌能以CO2作为唯一碳源。例如：牛链球菌发酵生产多糖，最重要的发酵条件是提供的空气中要含5%的CO2。第六十一页，共一百零九页，编辑于2023年，星期五（2）但在大多数情况下，对发酵是抑制作用。CO2对菌体生长的作用：直接影响——排出CO2高于4%时，碳水化合物的代谢及微生物的呼吸速率下降。

举例：发酵液中溶解CO2浓度为1.6×10-2mol/L时，会严重抑制酵母生长。当进气口CO2含量占混合气体体积的80%时，酵母活力只达到对照组的80%。一般以1L/(L·min)的空气流量通气发酵，发酵液中溶解CO2只达到抑制水平的10%。CO2影响产物形成：阻碍基质分解和ATP生成，影响产物的合成。

举例：CO2分压0.008MPa，青霉素合成速度降低40%；氨基糖苷类抗生素紫苏霉素生产：通以1%CO2，微生物对基质的代谢极慢，菌丝增长速度降低，紫苏霉素的产量比对照组降低33%。通入2%CO2，紫苏霉素的产量比对比照组降低85%，CO2的含量超过3%，则不产生紫苏霉素。CO2影响菌体形态：例如：产黄青霉菌接种到溶解不同CO2浓度的培养基中，发现：

CO2分压0～8%时，菌丝主要是丝状；

CO2分压15%～22%，则膨胀，粗短的菌丝占优势；

CO2为0.008MPa时，则出现球状或酵母状细胞，致使青霉素合成受阻，其比生成速率降低40%左右。第六十二页，共一百零九页，编辑于2023年，星期五3、CO2对发酵影响的机理（1）CO2对细胞的作用机制：

CO2作用在细胞膜的脂肪核心部位。

HCO3-影响磷脂、亲水头部带电荷表面及细胞膜表面的蛋白质。

当细胞膜的脂质相中CO2浓度达临界值时，使膜的流动性及表面电荷密度发生变化，导致许多基质的膜运输受阻，影响细胞膜的运输效率，使细胞处于“麻醉”状态，细胞生长受到抑制，形态发生改变。（2）CO2与发酵环境

大发酵罐中CO2的分压是液体深度的函数，10m深的发酵罐在0.101MPa气压下操作，底部CO2分压是顶部CO2分压的2倍。如不提高搅拌转数，CO2就不易排出，在罐底形成碳酸，进而影响菌体的呼吸和产物的合成。为了排除CO2的影响，必须考虑CO2在培养液中的溶解度，温度及通气情况。CO2溶解度大，对菌生长不利。采用增加罐压的方法来消泡会增加CO2的溶解度。第六十三页，共一百零九页，编辑于2023年，星期五3、呼吸商（RQ值）RQ=CER（二氧化碳释放率）OUR（摄氧率）呼吸商变化的生理意义表征不同的代谢途径

厌氧代谢、耗氧代谢；不同的耗氧代谢途径间的差异

例如：酵母发酵

RQ=1，糖有氧代谢，生成菌体，无产物形成；

RQ>1.1，糖经EMP生成乙醇。表征不同的基质利用情况

基质还原性强与弱的差异

例如：E.Coli以琥珀酸为基质，RQ=1.12；

以乳酸为基质，RQ=1.02

以葡萄糖为基质，RQ=1.00。表征不同的代谢阶段青霉素发酵理论RQ——生长、维持、产物生产阶段分别为0.909、1.0和4.0。发酵早期：主要是菌生长，RQ<1；

过渡期：维持菌体生命活动，产物逐渐形成，基质葡萄糖的代谢不仅仅用于菌体生长，RQ比生长期略有增加。

产物形成期：对RQ的影响较为明显，如产物还原性比基质大，RQ增加；产物氧化性比基质大，RQ就减少。其偏离程度决定于每单位菌体利用基质所形成的产物量。第六十四页，共一百零九页，编辑于2023年，星期五CO2在发酵液中的浓度大小受到许多因素的影响：菌体呼吸强度，发酵液流变学特性，通气搅拌程度，外界压力大小，设备规模大小也有影响。

通气搅拌调节CO2的溶解度：在3m3发酵罐中进行四环素发酵试验，发酵40h以前，通气量减小到75m3/h，搅拌为80r/min，提高CO2的浓度；40h以后，通气量和搅拌分别提高到110m3/h和140r/min，降低CO2浓度，使四环素产量提高25%～30%。发酵过程中存在着不完全氧化的中间代谢产物会使实际测定的RQ值偏低。消泡剂具有不饱和性和还原性，使RQ值偏低。CO2浓度控制应随它对发酵的影响而定——

CO2抑制产物合成：降低浓度；CO2促进产物合成：提高浓度。CO2产生与补料密切相关

青霉素发酵，补糖会增加CO2的浓度和降低培养液的pH值。补加的糖用于菌体生长，菌体维持和青霉素合成产生CO2。增加的CO2和代谢产生的有机酸，又使培养液pH值下降。因此，补糖、CO2、pH值三者具有相关性，被用于青霉素补料工艺的控制参数，其中排气中的CO2量的变化比pH值变化更为敏感，所以，采用测定CER作为控制补糖速率参数。CO2形成的碳酸，可用除CaCO3以外的碱来中和。4、CO2浓度的控制第六十五页，共一百零九页，编辑于2023年，星期五本章主要内容第一节营养基质和菌体浓度的影响及控制第二节温度的影响及其控制第三节pH的影响及控制第四节溶氧的影响及控制第五节泡沫的影响及控制第六节二氧化碳和呼吸商第七节发酵终点的控制第八节发酵过程的控制第六十六页，共一百零九页，编辑于2023年，星期五第七节发酵终点的判断发酵类型不同，目的不同，判断终点的标准就不同。发酵生产能力及评价指标：生产能力(或称生产率,产率)：单位时间单位罐体积的产物积累量，单位一般为g/(L·h)或kg/(m3·h)；体积生产率：每升发酵液每小时形成的产物量；总生产率：放罐时发酵单位除以总发酵生产时间（包括发酵周期和总辅助操作时间）。第六十七页，共一百零九页，编辑于2023年，星期五经济因素：以最低的综合成本来获得最大生产能力的时间为最适发酵时间。最大产物量的积累往往并不对应生产能力最大，在产率降低时放罐，意味着单位电能和冷却水对应的产量下跌，因此降低了成本。产品质量因素：发酵时间长短对后续产物的质量和纯化工序有直接的影响。过早：尚未代谢的发酵物（如糖、可溶性蛋白、脂肪等），对分离纯化不利（这些物质能增加乳化作用，干扰树脂的交换作用）；过晚：菌体自溶，释放的蛋白酶会显著改变发酵液性质，甚至降解目的产物的产量，扰乱分离纯化作业计划。临近放罐时：加糖、补料或消泡剂要慎重。补料可根据糖消耗速率计算到放罐时允许的残留量来控制。判断发酵终点考虑的因素第六十八页，共一百零九页，编辑于2023年，星期五生化指标：产物浓度、氨基酸、菌体形态、pH、培养液外观、粘度等因素。菌体自溶的迹象：氨基氮↑，pH↑，菌体碎片增多，黏度增大，过滤速度降低。发酵类型：对发酵及原材料成本占整个生产成本主要部分的发酵品种,主要追求提高生产率(kg/m3·h)，得率(kg产物/kg基质)和发酵系数(kg产物/罐容积m3·发酵周期h)；下游提取精制成本占主要部分和产品价格比较贵，除了要求高的产率和发酵系数外，还要求高的产物浓度。特殊因素：异常情况下，如染菌，代谢异常（糖耗缓慢等）时，应根据具体情况适当处理。如及时改变温度或补充营养，并适当拖后放罐时间等。第六十九页，共一百零九页，编辑于2023年，星期五本章主要内容第一节营养基质和菌体浓度的影响及控制第二节温度的影响及其控制第三节pH的影响及控制第四节溶氧的影响及控制第五节泡沫的影响及控制第六节二氧化碳和呼吸商第七节发酵终点的控制第八节发酵过程的控制第七十页，共一百零九页，编辑于2023年，星期五第八节发酵过程的控制作为生产企业，追求低投入、高产出是其所追求的永恒目标，这就要求寻求生化反应系统的最优化，在于通过实验和实验结果分析找到一种适合生产过程的最佳参数。发酵系统是一个多层次的、多输入多输出的网络状态的互动系统。宏观的信息流、物质流和能量流的变化实际上和微生物的代谢流息息相关。当生物反应器尺寸或操作条件变化时，发生的结果变化不是简单的用线性关系或平均统计方法所能描述的物质状态的变化。导致过程变化的原因除了线性或动力学因素之外，往往还发生在系统结构性的突变。因此，对发酵过程的精确检测，利用计算机技术、传感技术、自动控制技术和信息技术为主导的计算机对发酵过程的控制，以及利用计算机提供的实时监测数据对发酵工艺的优化是发酵工业中的一个重大的研究领域。第七十一页，共一百零九页，编辑于2023年，星期五一、发酵过程的精确检测二、发酵过程的计算机控制三、工艺控制优化第七十二页，共一百零九页，编辑于2023年，星期五一、发酵过程的精确检测（一）发酵过程检测的参数（二）发酵传感器第七十三页，共一百零九页，编辑于2023年，星期五（一）发酵过程的参数检测1、物理参数检测参数检测方法单位影响温度铂电阻热敏电阻℃μqpc*罐压（0.2～0.5×105Pa）隔膜传感器压敏电阻Pa保持正压，防止染菌O2及CO2的溶解度搅拌转速频率计数器r/minKLa发酵液的均匀性搅拌功率（2～4kW/m3）功率计KWKLa空气流量浮子流量计m3∙h-1KLa孔板差压计vvm粘度旋转粘度计Pa∙sKLa浊度浊度计%反映单细胞的生长料液的流量蠕动泵荷重传感器量筒L∙h-1S第七十四页，共一百零九页，编辑于2023年，星期五2、化学参数检测参数检测方法单位影响及作用pHg∙L-1菌体和产物合成速度；酶促反应的方向基质浓度HPLCg∙L-1菌生长和产物合成产物浓度生物传感器取样发酵周期的长短氧化还原电位氧化还原电位电极mV生长和生化活性溶氧浓度覆膜氧电极%反应异常、发酵中间控制参数、设备供氧能力气相O2含量顺磁氧分析仪Pa反映产生菌的摄氧率气相CO2含量红外气体分析仪%反映产生菌呼吸放出的CO2第七十五页，共一百零九页，编辑于2023年，星期五3、生物参数检测参数检测方法影响菌丝形态取样显微镜观察反映菌体发育阶段正常与否菌体浓度浊度法、干重法、离心称湿重法、沉淀测体积法、显微计数法、平板计数法等控制微生物发酵的重要参数之一影响菌体的生化反应细胞浓度在线浊度检测计细胞浓度在线浊度检测计第七十六页，共一百零九页，编辑于2023年，星期五4、间接状态参数第七十七页，共一百零九页，编辑于2023年，星期五（二）发酵传感器第七十八页，共一百零九页，编辑于2023年，星期五1、发酵工业对传感器的要求由于微生物培养过程是纯培养过程，无菌要求高，因此对传感器有特殊要求：插入罐内的传感器必须能经受高压蒸汽灭菌（材料、数据）传感器结构不能存在灭菌不透的死角，以防染菌（密封性好）传感器对测量参数要敏感，且能转换成电信号（响应快、灵敏）传感器性能要稳定，受气泡影响小。第七十九页，共一百零九页，编辑于2023年，星期五2、发酵用传感器的分类（1）按测量方式分离线传感器：不安装在发酵罐内，人工取样在线传感器：自动测定，流动注射分析系统（FIA），（HPLC）或质普仪等原位传感器：直接与发酵液接触，给出连续的响应信号，如温度、压力、pH、溶氧等（2）按测量原理分力敏元件：包括各种压敏元件、速度与加速度元件、压差元件；热敏元件：包括测温元件和测热元件；光敏元件：如光导纤维、光电管等电化学传感器：以电化学为基础，可将非电信号转换为电信号，如pH传感器、溶氧传感器。第八十页，共一百零九页，编辑于2023年，星期五3、发酵过程的主要在线传感器（1）pH-复合玻璃电极原位蒸汽灭菌的复合传感器包括一只玻璃电极和一只参比电极（与培养基连通）装在加压护套内第八十一页，共一百零九页，编辑于2023年，星期五（2）溶氧-复膜溶氧探头管状银阳极、铂丝阴极、氯化银电解液和极化电源组成的极谱型原理：产生的电流正比于通过膜扩散入探头的氧量阴极还原:O2+2H2O+4e-4OH-阳极氧化:4Ag+4Cl-4Ag++4Cl-+4e-总反应:O2+2H2O+4Ag+4Cl-4OH-+4AgCl第八十二页，共一百零九页，编辑于2023年，星期五（3）氧化还原电位测定发酵液中氧化剂（电子供体）和还原剂（电子受体）之间平衡的信息用一种由Pt电极和Ag/AgCl参比电极组成的复合电极与具有mV读数的pH计连接原理：氧化还原电位随发酵液中氧化成份和还原成份之比的对数而变化，与pH呈线性关系，受温度和溶氧压的影响发酵液中溶氧压很低时，超出溶氧探头的极限，氧化还原电位可弥补这一点（4）溶CO2-CO2探头较高的分压抑制微生物生长并降低次级代谢产物的量由一支pH探头浸入被可穿透CO2的膜包裹的碳酸氢盐缓冲液中缓冲液与被测发酵液中的CO2分压保持平衡，缓冲液的pH可间接表示发酵液中的CO2分压第八十三页，共一百零九页，编辑于2023年，星期五4、发酵检测用新型传感器对生物反应中重要的参数如生物量、基质和产物浓度的信息（1）离子选择电极是对某种离子呈特异性反应的电化学传感器由离子选择膜、连通介质和参比电极组成灵敏度高（ppm），但不能蒸汽灭菌（2）生物传感器将生物学敏感材料固定化的传感器，将生物信号转化为电信号生物学元件：由单酶、多酶体系、抗体、细胞器、细菌、动植物细胞或组织等生物材料通过表面共价结合、物理吸附、包埋而固定转换器：电位计、安培计、量热计、光度计信号、数据处理系统第八十四页，共一百零九页，编辑于2023年，星期五代表性生物传感器转换器类型检测对象生物学元件检测信号安培计葡萄糖葡萄糖氧化酶H2O2酒精乙醇氧化酶H2O2乳酸乳酸脱氢酶NADH葡萄糖Pseudo.FluorescensO2AMPAMP脱氢酶O2电位计尿素脲酶NH4+GluE.coliCO2青霉素青霉素酶H+热敏电阻Vc抗坏血酸氧化酶热量乙醇醇氧化酶热量第八十五页，共一百零九页，编辑于2023年，星期五二、发酵过程计算机控制传统发酵工业的工艺管理和控制多数采用人工操作的方式，严重地影响和制约了工艺水平和管理水平的提高，并导致生产不稳定、发酵转化率低、能耗大、高成本等问题。20世纪60年代以来，计算机控制技术开始应用于发酵工业生产，不仅解决了上述问题而且还能减轻工人的劳动强度，获得最大的经济效益，因此极大地推进了发酵工业的革新和发展。并且，随着大型计算机造价的降低和微型计算机使用的普及，生物传感器技术的发展，发酵动力学模型研究的完善，使得越来越多的发酵工业过程和产品采用计算机控制技术，目前已广泛应用于抗生素、啤酒、谷氨酸及酶制剂等众多与工农业、医药生产密切相关的产品的发酵生产。第八十六页，共一百零九页，编辑于2023年，星期五（一）计算机在发酵过程中的主要功能（引自王高平等：发酵过程的计算机监测和控制）过程数据的分析过程数据的存储过程控制第八十七页，共一百零九页，编辑于2023年，星期五（二）计算机控制系统及其功能1、计算机发酵过程控制系统的组成2、发酵过程控制的三个层次（1）第一级水平的控制包括阀、泵的开关、仪表的重新校对、在线维持及故障切断过程等顺序操作，发酵过程中的灭菌及培养基分批作业属于这一级水平的控制。此