矿质元素对植物的作用(3级)

综合实验3矿质元素对植物的作用二、实验意义(一）硝酸还原酶活性的测定硝酸还原酶(NR)是硝酸盐同化中第一个酶，也是限速酶，处于植物氮代谢的关键位置。它与植物吸收利用氮肥有关，对农作物产量和品质有重要影响，因而硝酸还原酶活性被当作植物营养或农田施肥的指标之一，也可作为品种选育的指标之一。目前一页\总数三十页\编于四点综合实验3矿质元素对植物的作用二、实验意义（二）植物体内硝态氮含量的测定1、植物体内硝态氮含量可反映土壤氮素供应情况，常作为施肥指标。2、蔬菜类作物特别是叶菜和根菜中常含有大量硝酸盐，在烹调和腌制中可转化为亚硝酸盐而危害健康，故硝酸盐含量又成为蔬菜及其加工品的重要品质指标。目前二页\总数三十页\编于四点综合实验3矿质元素对植物的作用三、实验基本原理(一）硝酸还原酶活性的测定硝酸还原酶是一种诱导酶，受到NO3-的诱导，在未供应NO3-之前，细胞中不存在已合成的硝酸还原酶，也找不到编码这种蛋白的mRNA。当供给NO3-数小时后，即有硝酸还原酶的合成。此外，光照、还原性糖以及叶绿体正常功能等也是诱导植物NRmRNA基因表达的重要影响因素。目前三页\总数三十页\编于四点综合实验1矿质元素对植物的作用三、实验基本原理(一）硝酸还原酶活性的测定采用真空渗入法使NO3-进入植物组织，并在硝酸还原酶作用下还原为NO2-，产生的亚硝态氮在酸性溶液中与对-氨基苯磺酸形成重氮盐，再与α-萘胺定量生成红色偶氮化合物，生成的红色偶氮化合物在520nm有最大吸收峰，可用分光光度法测定。硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。NO3－+NADH+H+——→NO2－+NAD++H2ONRase目前四页\总数三十页\编于四点综合实验3矿质元素对植物的作用三、实验基本原理（一）硝酸还原酶活性的测定目前五页\总数三十页\编于四点综合实验3矿质元素对植物的作用三、实验基本原理（二）植物体内硝态氮含量的测定在酸性条件下，NO3-与水杨酸反应，生成硝基水杨酸，生成的硝基水杨酸在碱性条件下（pH＞12）呈黄色，最大吸收波长为410nm，在一定范围内，其颜色的深浅与含量成正比，可直接比色测定。该方法测定硝态氮含量十分稳定可靠。目前六页\总数三十页\编于四点综合实验3矿质元素对植物的作用四、仪器试剂（一）硝酸还原酶活性的测定（309实验室）1、实验组玻璃仪器：(1)50ml三角瓶4个(2)试管4根(3)打孔器2个(4)玻棒2根(5)移液管7根试剂：(1)PH7.5磷酸缓冲液(2)0.2molKNO3

(3)1%(w/v)磺胺(4)1%(w/v)α-萘胺(5)蒸馏水目前七页\总数三十页\编于四点综合实验3矿质元素对植物的作用四、仪器试剂（一）硝酸还原酶活性的测定（309实验室）2、标准曲线组玻璃仪器：

(1)试管7根(2)移液管5根试剂：

(1)1%(w/v)磺胺(2)1%(w/v)α-萘胺(3)蒸馏水(4)5ug/mlNaNO2目前八页\总数三十页\编于四点综合实验3矿质元素对植物的作用四、仪器试剂（二）植物体内硝态氮含量的测定（310实验室）1、实验组玻璃仪器：(1)试管4根(2)烧杯和漓管(3)25ml容量瓶2个(4)漏斗2个(5)弯颈漏斗2个(6)玻棒2根(7)移液管5根试剂：(1)5%水杨酸－硫酸溶液(2)8%NaOH水溶液(3)蒸馏水目前九页\总数三十页\编于四点综合实验3矿质元素对植物的作用四、仪器试剂（二）植物体内硝态氮含量的测定（310实验室）2、标准曲线组玻璃仪器：(1)50ml容量瓶8个(2)试管9根(3)移液管8根试剂：(1)5%水杨酸－硫酸溶液(2)8%NaOH水溶液(3)蒸馏水(4)500mg／LKNO3目前十页\总数三十页\编于四点综合实验3矿质元素对植物的作用五、实验材料1、水稻、小麦、玉米、大豆、棉花、蓖麻、烟草、向日葵等农作物叶片及地下部；2、黄瓜、茄子、辣椒、豆角、大白菜、萝卜等蔬菜绿叶、心叶、菜心、菜帮、地下部等；3、八仙花、红叶石楠、大叶黄杨、海桐、木芙蓉、紫荆、珊瑚树等园林植物叶片；4、枫香、木荷、梧桐、泡桐等林木叶片。目前十一页\总数三十页\编于四点综合实验3矿质元素对植物的作用六、实验设计1、比较不同N素形式(NO3-、NH4+、尿素)对NR活性的诱导作用及植物体内硝态氮含量的影响；2、探讨光照、温度、pH对NR活性的影响；3、不同种类还原糖对NR活性的影响；4、不同植物NR活性及硝态氮含量的差异；5、同一植物不同器官或不同生长时期NR活性及硝态氮含量的差异；6、探讨不同土壤条件下硝态氮含量的差异。

目前十二页\总数三十页\编于四点管号1234567亚硝酸钠标准液（ml）00.10.20.40.60.81.0蒸馏水（ml）1.00.90.80.60.40.201％对－氨基苯磺酸（ml）22222220.2%α-萘胺（ml）2222222每管含NO2-(ug)00.10.20.40.60.81.0七、实验步骤（一）硝酸还原酶活性的测定1.标准曲线制作取1mlNaNO2标准液(空白用H2O)→→2ml磺胺试剂→2mlα-萘胺试剂摇匀，室温静置30min→520nm比色目前十三页\总数三十页\编于四点标准溶液显色情况目前十四页\总数三十页\编于四点综合实验3矿质元素对植物的作用

（2013年5月14上午）目前十五页\总数三十页\编于四点综合实验3矿质元素对植物的作用

（2013年5月15日下午）目前十六页\总数三十页\编于四点5ml磷酸缓冲液5mlH2O5mlKNO3称量0.3～0.5g等重材料2份分别置于三角瓶①、②三角瓶①、②置于干燥器，真空抽气①②30℃恒温箱中黑暗保温30min取反应液1ml+2ml磺胺试剂+2mlα-萘胺试剂①②摇匀，室温静置显色30min520nm比色、查标准曲线、计算放气后摇晃材料下沉注意加液顺序目前十七页\总数三十页\编于四点硝酸还原酶活性测定操作过程目前十八页\总数三十页\编于四点管号12345678硝酸钾标准液（ml)1234681012蒸馏水（ml)4948474644424038每管硝酸氮含量(ug/ml)102030406080100120七、实验步骤（二）植物体内硝态氮含量的测定1.标准曲线制作取0.1mlKNO3标准液(空白用H2O)→→0.4ml5%水杨酸-硫酸→摇匀，室温下静置20min加8%NaOH溶液9.5ml，摇匀冷却→410nm比色目前十九页\总数三十页\编于四点标准溶液显色情况目前二十页\总数三十页\编于四点综合实验3矿质元素对植物的作用

(2013年5月14日)目前二十一页\总数三十页\编于四点综合实验3矿质元素对植物的作用

(2013年5月14日下午）目前二十二页\总数三十页\编于四点综合实验3矿质元素对植物的作用

(2013年5月15日下午）目前二十三页\总数三十页\编于四点精确称取剪细、混匀植物材料，每份1.0～2.0g放入试管，加去离子水10ml，弯颈漏斗封口沸水浴中提取30min，自来水冷却过滤到25ml容量瓶，去离子水冲洗残渣，定容取试管1支，加0.1ml样品液加5%水杨酸-硫酸0.4ml，摇匀，室温静置20min

加8%NaOH溶液9.5ml，摇匀冷却410nm比色，查标准曲线溶液加到试管底部，以免影响结果用强酸、强碱注意安全，如外溅，立即用水冲洗和擦洗目前二十四页\总数三十页\编于四点硝态氮含量测定操作过程目前二十五页\总数三十页\编于四点（一）硝酸还原酶活性的测定硝酸还原酶活性(μg·g-1·h-1)﹦（②N02-含量-①N02-含量）×10/W×t其中：②NO2-含量为反应液②中亚硝态氮含量(ug)；①NO2-含量为反应液①中亚硝态氮含量(ug)；W为样品重量(g)；t为反应时间(h)。八、结果与分析目前二十六页\总数三十页\编于四点（二）植物体内硝态氮含量的测定硝态氮含量(mg·g-1FW)

=(C×V)/W其中:

C为标准方程计算得NO3-－N浓度(ug·ml)；V为提取样品液总量(ml)；W为样品鲜重(g)。八、结果与分析目前二十七页\总数三十页\编于四点综合实验3矿质元素对植物的作用九、注意事项（一）硝酸还原酶活性的测定1、该酶为诱导酶，可于实验前一两天，用硝酸盐进行叶面喷施以增强其活性。取回材料后注意冲洗叶片上残留的硝酸盐。2、取样前材料应照光3h以上，大田取样在上午9点后为宜，阴雨天不宜取样。取样部位应尽量一致。3、硝酸盐还原过程应在黑暗中进行，以防止亚硝酸盐还原为氨。。4、显色到比色时间要一致，过短过长对影响颜色。目前二十八页\总数三十页\编于四点综合实验3矿质元素对植物的作用九、注意事项（二）植物体内硝态氮含量的测定1、分光光度计、比色杯用水冲洗，擦镜纸擦净；比色杯倒液不超2/3；用完后及时洗净!