高效液相简介及常见问题

高效液相色谱简介简介：高效液相色谱法（HighPerformanceLiquidChromatography\HPLC）又称“高压液相色谱”、“高速液相色谱”、“高分离度液相色谱”、“近代柱色谱”等。高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术应用高效液相色谱简介特点：高效液相色谱法有“四高一广”的特点：

1.高压：流动相为液体，流经色谱柱时，受到的阻力较大，为了能迅速通过色谱柱，必须对载液加高压2.高速：分析速度快、载液流速快，较经典液体色谱法速度快得多，通常分析一个样品在15～30分钟，有些样品甚至在5分钟内即可完成，一般小于1小时3.高效：分离效能高。可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果，比工业精馏塔和气相色谱的分离效能高出许多倍4.高灵敏度：紫外检测器可达0.01ng，进样量在μL数量级5.应用范围广：百分之七十以上的有机化合物可用高效液相色谱分析，特别是高沸点、大分子、强极性、热稳定性差化合物的分离分析，显示出优势6.柱子可反复使用：用一根柱子可分离不同化合物

7.样品量少、容易回收：样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备高效液相色谱简介

此外高效液相色谱还有色谱柱可反复使用、样品不被破坏、易回收等优点，但也有缺点，与气相色谱相比各有所长，相互补充。高效液相色谱的缺点是有“柱外效应”。在从进样到检测器之间，除了柱子以外的任何死空间（进样器、柱接头、连接管和检测池等）中，如果流动相的流型有变化，被分离物质的任何扩散和滞留都会显著地导致色谱峰的加宽，柱效率降低。高效液相色谱检测器的灵敏度不及气相色谱

高效液相色谱简介HPLC仪器的配置及流程：高效液相色谱简介色谱分离的机理：高效液相色谱简介色谱的图形结果：高效液相色谱简介色谱柱进样阀脱气装置流动相检测器高压泵构造：高效液相色谱简介高效液相色谱构造：

输液泵：多用柱塞往复泵，柱塞向前运动，液体输出，流向色谱柱；向后运动，将贮液瓶中液体吸入缸体。如此往复运动，将流动相源源不断地输送到色谱柱中高效液相色谱简介高效液相色谱构造：色谱柱：常用的色谱柱填料有硅胶和化学键合硅胶。后者以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用辛基键合硅胶次之，氰基或氨基键合硅胶也有使用；离子交换填料用于离子交换色谱；凝胶或玻璃微球等，用于分子排阻色谱等高效液相色谱简介高效液相色谱构造：色谱柱：在选定的条件下，注入供试品溶液或各品种项下规定的内标物质溶液，记录色谱图

化学键合固定相应用，量出供试品主成分或内标物质峰的保留时间t(R)和半高峰宽W(h/2)，按n=5.54[t(R)╱W(h/2)]^2计算色谱柱的理论板数，如果测得理论板数低于各品种项下规定的最小理论板数，应改变色谱柱的某些条件（如柱长、载体性能、色谱柱充填的优劣等），使理论板数达到要求高效液相色谱简介高效液相色谱构造：检测器：分为紫外检测器和荧光检测器。紫外检测器：是基于溶质分子吸收紫外光的原理设计的检测器，其工作原理是Lambert-Beer定律，即当一束单色光透过流动池时，若流动相不吸收光，则吸收度A与吸光组分的浓度C和流动池的光径长度L成正比

高效液相色谱简介高效液相色谱构造：荧光检测器：是高压液相色谱仪常用的一种检测器。用紫外线照射色谱馏分，当试样组分具有荧光性能时，即可检出高效液相色谱简介高效液相色谱构造：流动相：

1.溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性和良好的选择性2.溶剂要与检测器匹配。对于紫外吸收检测器，应注意选用检测器波长比溶剂的紫外截止波长要长3.高纯度。由于高效液相灵敏度高，对流动相溶剂的纯度也要求高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生“伪峰”。痕量杂质的存在，将使截止波长值增加50～IOOnm4.化学稳定性好。不能选与样品发生反应或聚合的溶剂5.低粘度。若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分离。常用的低粘度溶剂有丙酮、乙醇、乙晴等。但粘度过于低的溶剂也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它们易在色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离.高效液相色谱简介HPLC的主要类型：液一液分配色谱法（LLPC）：在液-液色谱中,流动相和固定相都是液体,它能适用于各种样品类型的分离和分析，无论是极性的和非极性的，水溶性和油溶性的，离子型的和非离子型的化合物分离原理：液液分配色谱的分离原理基本与液液萃取相同，都是根据物质在两种互不相溶的液体中溶解度的不同，具有不同的分配系数。所不同的是液液色谱的分配是在柱中进行的，使这种分配平衡可反复多次进行，造成各组分的差速迁移，提高了分离效率，从而能分离各种复杂组分高效液相色谱简介HPLC的主要类型：液一液分配色谱法（LLPC）：固定相：液液色谱的固定相由载体和固定液组成，通常有以下几类；1.全多孔型载体：由硅胶、硅藻土等材料制成，直径约100m的全多孔型颗粒，这类固定相由于颗粒很细，孔仍然较浅，传质速率快，易实现高效、高速。特别适合复杂混合物分离及痕量分析2.表面多孔型载体（薄壳型微珠载体）：由直径为30~40m的实心玻璃球和厚度约为1~2m的多孔性外层所组成。目前，这种载体粒度为5~10m

流动相：根据所使用的流动相和固定相的极性程度，将其分为正相分配色谱和反相分配色谱高效辰液相薪色谱即简介HP洁LC的主国要类女型：液一求液分雨配色抽谱法鞠（LL爸PC）：正相帖液-液分系配色罪谱法(N雨or抽ma椒l引Ph理as键e芹li岁qu蹄id屈C厨hr挎om计at胸og耕ra沟ph葛y)蔑:流动禽相的因极性元小于李固定钞液的拳极性反相巧液-液分浊配色雷谱法(R疲ev爷er码se孤P渗ha桐se赢l储iq喇ui绝d独Ch堤ro躁ma轮to令gr心ap喂hy映):流动嘉相的架极性汇大于术固定奴液的灯极性液-液分般配色季谱法营的缺城点：尽管测流动宗相与辛固定独相的小极性驳要求撒完全钩不同老，但岸固定糊液在夕流动慰相中纵仍有夸微量舞溶解摸；流蛙动相金通过田色谱浊柱时羡的机冤械冲应击力公，会病造成辩固定剪液流摘失高效杂液相共色谱铸简介HP徐LC的主容要类蔬型：液一机固吸踏附色泪谱法(L兆SA糖C)：液一岩固吸淘附色狱谱是军以固热体吸禾附剂孝作为乓固定战相，俊吸附呈剂通逼常是然些多板孔的裁固体怀颗粒赛物质狼，在价它们梅的表封面存塘在吸猜附中鬼心。确液固萌色谱葡实质滨是根龟据物躺质在宗固定殃相上耽的吸疏附作厌用不答同来蹈进行础分离触的分离纤原理：当惹流动州相通脏过固个定相岛（吸牺附剂折）时浩，吸笑附剂罗表面未的活监性中贯心就倒要吸皆附流南动相荒分子浮。同礼时，坏当试归样分店子（X）被武流动致相带族入柱帖内，莫只要筛它们签在固油定相芬有一拣定程柱度的衔保留临就要渴取代医数目另相当锁的已锣被吸弃附的吓流动浓相溶偷剂分课用）义于是夸，在头固定快相表唱面发墨生竞壶争吸挠附X充+御nSad=鞋Xad+追nS高效缩慧液相兄色谱认简介HP拾LC的主传要类研型：液一栋固吸狐附色殿谱法(L土SA偷C)：固定摘相：液－园固吸票附色龙谱所旅用固贩定相揉多是佳一些欢吸附树活性叮强弱传不等浊的吸守附剂灶，如内硅胶联、氧摩化铝闻、聚户酸胶蒙等。搏由于茫硅胶停的优康点较谜多，钟如线旦性容显量较金高，炭机械探性能想好，雀不溶坝胀，状与大钓多数述试样作不发演生化该学反建应等灰，因栋此，层以硅捧胶用渡得最巾多目前倡最广纸泛使葱用的兄还是5～10m的全多每孔型接微粒坏填料流动均相：一般挤把吸徒附色喉谱中白流动障相称素作洗元脱剂。在吸慢附色益谱中括对极坦性大吨的试溜样往牺往采剃用极劣性强剩的洗示脱剂沿；对伐极性捉弱的榨试样钱宜用臣极性自弱的哄洗脱喷剂高效厦液相捏色谱犁简介HP站LC的主基要类霸型：离子吵交换仪色谱预法（IE亦C）：此法键是利圆用离睬子交克换原堵理和挂液相拖色谱志技术艘的结愉合来张测定赛溶液何中阳黎离子死和阴吃离子平的一费种分林离分嫂析方始法。搬凡在纸溶液尿中能坊够电迫离的丝式物质芦，通伶常都伶可用捧离子旱交换谱色谱微法进园行分滑离。面它不蒸仅适卸用无塘机离旺子混域合物狮的分件离，活亦可茫用于哪有机雨物的樱分离侮，例型如氨顺基酸吸、核芬酸、挣蛋白捉质等忍生物消大分摄子。绞因此运，应以用范稼围较弟广离子筝交换甲原理困：离子蛙交换络色谱设法是畜利用拦不同漏待测深离子岩对固宜定相铁亲和掩力的铁差别隙来实算现分违离的张。其摄固定信相采风用离浑子交茧换树煤脂，容树脂乓上分槽布有好固定罩的带出电荷找基团紧和可陪游离坐的平只衡离叙子。枝当待郊分析朽物质排电离瞒后产诱生的月离子箭可与随树脂傲上可违游离村的平拖衡离奇子进炉行可粮逆交天换高效咽液相缺色谱逗简介HP煮LC的主戒要类窝型：离子甩交换角色谱狭法（IE榆C）：固定广相：1.多孔姐型离够子交泛换树赢脂：攀它主切要是激聚苯慈乙烯务和二斩乙烯庄苯基敬的交包联聚嚼合物永，直拾径约愤为5～20守μm，有爷微孔辫型和支大孔师型之到分2.薄膜手型离恼子交国换树兴脂短：它无是在段直径肾约对30犁μm的固创体惰师性核稍上，惯凝聚1～2μ栏m厚的四树脂具层3.表面倾多孔血型离招子交愿换树肃脂：吉它是课在固衰体情仔性核早上，选覆盖息一层捷微球烧硅胶盗，再则在上戴面涂委一层羡很薄犁的离献子交铜换树炼脂流动仙相：离子问交换冷色谱亏法所析用流梦动相肥大都税是一站定pH和盐慌浓度预（或绿离子耀强度雀）的晌缓冲松溶液全。通笼过改抚变流莲动相巾中盐师离子浅的种端类、舒浓度分和pH值可储控制k值，占改变象选择光性。有时组也使畅用有宏机溶缘瑞剂如晃甲醇横或乙浴醇同婶水缓址冲溶连液混拴合使斜用，炉以提袄高特译殊的才选择腔性，则并改胀善样霞品的爆溶解辛度高效吸液相雾色谱量简介HP逆LC的主敞要类吗型：离子烛对色坚谱法克（IP龙C）：离子说对色馋谱法窄是分哑离分求析强蹄极性脂有机鼠酸和即有机妖碱的不极好登方法得。离层子对碌色谱密法是确将一运种（喊或数渴种）先与溶说质离介子电挂荷相幻玉反的阻离子捡（称旧对离灰子或如反离妻子）谈加到凯流动安相或劫固定候相中绣，使铸其与贫溶质指离子纳结合揪形成海离子膝对，以从而枪控制促溶质众离子眠保留豪行为妖的一里种色月谱法分离窑原理案：由于捷离子蜓对化榨合物A-B+具有亦疏水价性，识因而絮被非特极性欲固定矮相（率有机甜相）仰提取腐。组太分离牢子的跳性质明不同划，它侧与反洒离子卧形成跟离子隶对的销能力圣大小陪不同远以及枪形成江的离逆子对壁流水叶性质执不同君，导优致各叫组分株离子蒸在固界定相万中滞耗留时担间不哲同，扔因而旋出峰李先后姿不同高效耽液相藏色谱框简介HP道LC的主酿要类氧型：离子尤对色霸谱法有（IP诊C）：固定扶相：非极弟性的聋疏水厉键合厨相流动以相：加有摄平衡尘离子藏（反脊离子辉）的班极性兰溶液另通过疏改变府流动欠相的pH、平趴衡抛离子粉的浓劫度和矿种类尝可改次变分皂离的鲜选择外性。高效欢液相之色谱社简介HP爹LC的主芬要类掠型：空间过排阻日色谱道法（SE疑C）：主要朵用于根较大喷分子摸的分安离。睛与其趴他液嚷相色暑谱方蚁法原爱理不哥同，除它不压具有税吸附制、分杯配和崖离子忘交换自作用郊机理坚，而箭是基苦于试且样分与子的代尺寸李和形胃状不佣同来成实现悬分离兆的分离伶原理未：空间提排阻圆色谱筝是按坛分子兔大小熟顺序退进行原分离起的一惰种色栋谱方旱法。母凝胶图内具笼有一离定大吩小的疤孔穴落，体蔽积大划的分掠子不忙能渗当透到脂孔穴酱中去盟而被逃排阻云，较躁早地倦被淋券洗出牵来；毅中等六体积题的分吹子部眠分渗帖透；现小分葱子可扬完全子渗透跑入内未，最犹后洗新出色轮谱柱高效额液相丙色谱裁简介HP侨LC的主宗要类答型：空间灶排阻抵色谱海法（SE间C）：固定驰相：排阻筒色谱售固定黎相种畏类很抬多，秆一般弄可分突为软陆性、局半刚茅性和头刚性旁凝胶姐三类膀。1.软性四凝胶岗如震葡聚腊糖凝苗胶、时琼脂盛糖凝耀胶都跑具有硬较小薄的交纱联结映构，坝其微响孔能算吸入樱大量仿的溶沫剂，抛并能纵溶胀伶到它全们干繁体的鸭许多悔倍。蚁它们膊适用哪以水陵溶性躲溶剂枪作流矿动相陶，一石般用拳于小际分子怠质量逆物质处的分东析，纲不适肠宜用嘴在高去效液慨相色骨谱中2.半刚枪性凝符胶美如肥高交胳联度翠的聚惩苯乙对烯（St朗yr远ag米el）比茫软性焰凝胶藏稍耐社压，驰溶胀牛性不企如软裹性凝菠胶。六常以持有机皱溶剂卡作流钓动相吵。用电于高瓦效液馋相色孩谱时谦，流离速不额宜大3.刚性哪凝胶厨如晨多孔荡硅胶到、多其孔玻脂璃等舟它们散既可沉用水久溶性访溶剂亡，又塔可用湾有机长溶剂遵作流灶动相蚁，可恩在较撒高压定强和钓较高留流速壤下操梨作。笑一般挥控制孝压强鼠小于7M叛Pa，流似速＜1c胶m3凑·s拉-1；否意则将或影响芝凝胶滨孔径啄，造誉成不经良分想离高效痰液相包色谱不简介HP哄LC的主累要类盐型：空间跟排阻劫色谱着法（SE鞋C）：流动物相：排阻援色谱凑所选大用的董流动拾相必秒须能野溶解网样品甜，并沟必须黎与凝知胶本馒身非餐常相怀似，例这样创才能愤润湿亲凝胶释。当甲采用维软性耍凝胶涌时，象溶剂毁也必膛须能缸溶胀符凝胶鸽。溶衔剂的春粘度封要小驳，因欣为高降粘度治溶剂者往往伍限制雁分子今扩散尝作用时而影迁响分享离效刚果。铸常用刃的流瓣动相床有四串氢呋策喃、革甲苯超、氯情仿、纯二甲轧基酸饮胺和腹水等高效员液相携色谱睛简介液相诵色谱绿分离庸类型景选择顺参考板表：高效骂液相伪