高效液相色谱知识

第二十章高效液相色谱法highperformanceliquidchromatography；HPLC分析化学教研室李发美教授1经典液相色谱法为基础，引入气相色谱法的理论和实验技术，高压输送流动相，高效固定相及高灵敏度检测器，现代液相色谱分析方法。

2与经典液相色谱法相比

颗粒极细（一般为10m以下）、规则均匀的固定相，(键合相)传质阻抗小，柱效高，分离效率高；高压输液泵输送流动相，流速快，分析速度快；高灵敏度检测器，灵敏度大大提高。紫外检测器最小检测限可达109g，而荧光检测器最小检测限可达1012g。

3与气相色谱法相比不受试样的挥发性和热稳定性的限制，应用范围广；可选用各种溶剂作为流动相，对分离的选择性有很大作用，选择性高；一般在室温条件下进行分离，不需要高柱温。

4第一节高效液相色谱法的主要类型和原理

一、主要类型 四类基本类型色谱法

分配色谱法（partitionchromatography）吸附色谱法（adsorptionchromatography）离子交换色谱法（IEC）空间排阻色谱法（SEC）5第一节高效液相色谱法的主要类型和原理

一、主要类型 四类基本类型色谱法

分配色谱法（partitionchromatography）吸附色谱法（adsorptionchromatography）离子交换色谱法（IEC）空间排阻色谱法（SEC）化学键合相色谱法6

其他色谱类型亲合色谱法（affinitychromatography；AC）手性色谱法（chiralchromatography；CC）胶束色谱法（micellarchromatography；MC）电色谱法（electrochromatography；EC）7二、化学键合相色谱法

以化学键合相为固定相的色谱法，简称键合相色谱法(bondedphasechromatography；BPC)化学键合相：采用化学反应的方法将官能团键合在载体表面所形成的固定相

8优点：固定相的均一性和稳定性好，在使用过程中不易流失，使用周期长；柱效高；重现性好；能使用的流动相和键合相的种类多，分离的选择性高正相（normalphase，NP）和反相（reversedphase，RP）键合相色谱法：根据化学键合相与流动相极性的相对强弱9（一）正相键合相色谱法

固定相：极性键合相如氰基（－CN）、氨基（－NH2）或二羟基键合硅胶。（经典：水饱和的硅胶）流动相：非极性或弱极性溶剂加极性调整剂如烷烃加醇类。（与水不混溶的溶剂）适用范围：溶于有机溶剂的极性至中等极性的分子型化合物如一些在硅胶柱上分离的物质10正相键合相色谱法分离机制？分配：把有机键合层作为一个液膜看待，溶质在两相的溶解吸附：溶质与键合极性基团间的诱导、氢键和定向作用分离选择性：极性强的组分k大，后洗脱出柱。流动相的极性增强，洗脱能力增加，使组分k减小，tR减小。11（二）反相键合相色谱法固定相：非极性键合相如十八烷基硅烷（C18，ODS）、辛烷基（C8）键合硅胶流动相：水为基础溶剂，加入一定量与水混溶的极性调整剂常用甲醇－水、乙腈－水等应用：最广。非极性至中等极性的组分，（还有有机酸、碱及盐等）

12保留机制疏溶剂理论（solvophobictheory）溶质的保留主要是溶质分子与极性溶剂分子间的排斥力，促使溶质分子与键合相的烃基发生疏水缔合。不是溶质分子与键合相间的色散力，13反相键合相色谱法保留行为的主要影响因素1、溶质的分子结构（极性）

极性越弱，疏水性越强，k越大，tR也越大。 同系物碳数越多，极性越弱，k越大； 引入极性取代基，降低疏水性，k值变小。2、固定相键合烷基的疏水性随碳链的延长而增加，溶质的k也增大。硅胶表面键合烷基的浓度越大，则溶质的k越大。

14反相键合相色谱法保留行为的主要影响因素3、流动相极性越强，洗脱能力越弱，使溶质的k越大溶剂种类：水为弱溶剂，醇为强溶剂溶剂比例：水的比例增加，使k增大中性盐的加入：使中性溶质的k增大pH：影响弱酸、弱减的离解 流动相的pH降低，弱酸k增大，tR增大；弱碱k变小。15离子哪抑制防色谱似法（io晒n粮su失pp齐re宜ss呆io嫩n颂ch赚ro幕ma奸to寸gr饥ap拣hy；IS择C）用少宫量弱倍酸、沸弱碱减或缓诸冲溶誓液，芽调节献流动惠相的pH，抑制饿有机针弱酸够、弱岸碱的至离解剥，增兰加疏绢水缔森合作然用，吼使k变大荣。适用甲于3≤稀pKa≤不7的弱晒酸、7≤束pKa≤颗8的弱志碱反相捏键合邀相色顾谱法16把离咸子对橡试剂玩加入曾到含故水流吹动相征中，遮组分悉离子筐在流鲜动相狼中与娇离子娘对试雪剂的散反离芝子（co编un悄te炉r痛io永n）生成中性梨离子援对，增屿加溶拐质与惕非极凝性固示定相己的作叔用，海使k增加舟，改决善分盛离效稻果。（三切）反看相离讯子对勉色谱奋法pa竞ir数ed渴i烧onch狭ro兰ma四to抽gr峰ap蹦hy；PI忍C僻io万n喘pa挤ir袍c购hr虫om代at紧og姻ra嘉ph圾y；IP哀C17反相宋离子丑对色杀谱法离子拦对模圾型33++()+3s3(+固定寨相+()+B)+B+H+BHRSONaRSO+Na+BHRSORSO)BH离子对mB+ABAmA(s流动产相通式18影响诉容量擦因子危的因井素离子厌对试禁剂的筋种类贩和浓卫度：宏碳链太长度傻增加昏，溶粉质的k增大镰；在闭一定阿范围炭内试桐剂的袍浓度饼升高功，溶上质的k增大流动津相的pH：有利凤于组合分和挖离子议对试睛剂离愤子化济时（残离子击对的畜形成哗），诞组分两的k值最婶大固定淡相统、流奖动相释性质缘瑞（同转一般RP感-H沾PL峰C）。19适用绑范围弊：有速机酸垫、碱阁、盐注，离慢子型滤和非押离子通型化赛合物掉的混颠合物距。分析郑酸类颂或带帝负电歇荷物躺质：迅用季器铵盐侮，如故四丁蜻基铵摊磷酸价盐（TB注A）和溴油化十姐六烷剪基三阴甲基雹铵（CT立AB）等分析摩碱类浸或带耐正电怕荷的光物质做：用签烷基痒磺酸庄盐或焰硫酸剖盐，患如正棵戊烷旅基磺致酸钠尽（PI取CB5）、正己做烷基壁磺酸嘉钠（PI毁CB6）、适用壤范围终和离领子对傍试剂旋的选休择20第二缓节乔高效锈液相桶色谱雨法的迈固定教相和巷流动蒜相及复其选闪择固定蓄相应部符合雕下列嫁要求访：颗粒混细且糠均匀诞；传质柿快；机械挽强度搁高，梅能耐榜高压果；化学逗稳定维性好斑，不蜂与流贤动相耽发生韵化学真反应纱。21一、梳化学录键合幼相色天谱法煮的固惕定相（一足）键巾合相钳的种贼类非极卡性键僚合相六：非极视性烃帐基，勒如C18﹑C8﹑C1与苯扶基等涛键合页在硅隐胶表吴面；用于用反相宝色谱喇；长链堵烷基锄可使固溶质矛的k增大舒，选连择性味改善拥，载梅样量里提高苍，稳苦定性花更好督。22键合泰相的压种类弱极双性键膨合相怨：醚基猴和二干羟基园等键部合相用于马反相广或正唤相色办谱极性编键合垫相：常用嫂氨基﹑氰基洲键合晒相（恩氰乙树硅烷汗基≡Si脸(C抹H2)2CN占)键合典硅胶一般译用于肌正相纳色谱特殊僻用途规的键事合相23（二垦）键昆合相戚的性越质和迎特点键合币反应硅氧肝烷（Si－O－Si－C）型：久氯硅跳烷与留硅胶王进行硅烷漂化反剥应如：YW挖G－C18H37，无定绣形硅冬胶YW衬G上键亦合了十八难硅烷妹基；Sp羞he漫ri男so才rbOD汉S，球形纲硅胶Sp僻he束ri武so璃rb上键葡合了OD续S。24键合诊相的健性质饼和特称点键合佳相的敞性质含碳贵量：吗含碳何的百稀分数覆盖演度抬：已窑反应阀的硅阵醇基催数目久占硅忽胶表需面硅罗醇基终总数忽的比南例封尾租（en克d-窗ca逢pp续in偿g）：在键汪合反略应后果，用饥三甲议基氯忙硅烷驶等进设行钝蜓化处钢理，返减少住残余肢硅醇挪基。25键合准相的话特点使用愧过程到中不理流失纤；化学唉稳定航性好初；适于那梯度公洗脱夜；载样娃量大注意单：流动浇相的pH一般刺应在3-看8，否驴则会启引起除硅胶章溶解牛；(也有怨适用鼻宽pH范围练的键匙合相)。键合滴相的贫性质介和特爷点26二、己化学背键合堂相色摔谱法汁的流域动相对流尿动相晨的要免求：与固全定相战不发肺生化包学反耐应。对试屋样有弃适宜垫的溶鹊解度帝。使k在1~匙10范围象内，与检具测器喉相适鞋应。胁例如跌用紫彻外检盛测器敞时，唉选用知截止大波长蔬小于篇检测赤波长近的溶乔剂。纯度著高，巧粘度娘小。惹低粘编度流态动相洗如甲朱醇﹑乙腈衣等可饥以降哄低柱吧压，符提高系柱效赚。27（一溪）流添动相今对分职离的炉影响n由色烫谱柱浩（固翅定相撞）性舌能决欧定，α主要盒受溶娘剂种乔类的约影响简，k受溶早剂配钥比的乞影响投。28（二）遣流动糖相的暂强度代和选筝择性溶剂缓的极漠性（成强度陷）正相浓色谱脏：溶皇剂极爆性越申强，谁洗脱寺能力吩越强反相邀色谱基：极钟性弱压的溶敏剂洗锦脱能冻力强溶剂慰的选挂择性不同辫种类洒的溶止剂，凶分子柱间的泽作用腾力不惨同，尸故选疤择性亿不同混合计溶剂于（二雅元或明多元鸽流动爪相）29三、捞分离毁条件剪的选耍择（一）HP勾LC中的挤速率设理论涡流沫扩散A=2λdp球形艰、小质粒度马、均抖匀（RS适D＜5%）固定头相，礼匀浆兆高压往填充需，以自降低A。纵向配扩散β=2γDm可以妄忽略久。因为Dl很小坦，室舟温操篇作，龙且U大于U最佳，30HP遇LC中的名速率否理论传质璃阻抗固定懒相传融质阻疫抗CS可以煤忽略柔，异因df极小流动垂相传移质阻舟抗Cm要求别：dp小，Dm大31静态城流动燃相传往质阻压抗止：由于东部分区流动呼相在娇固定依相微捡孔内槐的滞届留静态远流动植相传屯质阻颜抗系管数CsmCsm∝dp2，Csm∝1/Dm，而Dm∝T/η要求:固定句相dp2、流动递相η都小HP妄LC中的凯速率轮理论32H=A+Cmu+Csmu原因签：化炒学键兴合相降，液佛体流托动相结果捆：HP出LC的实茅验条条件应拿该是鸟：①小粒圈度、育均匀斤的球世形化彩学键吐合相也；②低粘鹿度流披动相尘，流涨速不垫宜过摆快；③柱温堂适当宜。HP格LC中的贪速率怎理论33（二挑）正派相键某合相锁色谱天法的竞分离手条件固定泉相极性问键合农相孩如氰卵基、讲氨基揭键合绒相等流动纺相烷烃派加适缠量极金性调社节剂34（三废）反夹相键显合相驰色谱迈法的层分离家条件固定语相非极概性键微合相划如OD躲S流动烈相以水昂为基像础溶耐剂，毕加入供甲醇陡、乙仅腈等葡极性坦调节娘剂弱酸释、弱跃碱或挠缓冲紫盐作浊为离版子抑刘制剂加入0.杨1%走∽1乎%的醋界酸盐脏、磷渗酸盐粗可减赖少残快余硅控醇基时的作后用35（四晓）反步相离惨子对沟色谱利法的腥分离丧条件固定轮相辨尽可谱能选批择表殃面覆汪盖度蠢高且帆疏水械性强来的非著极性条键合输相，离子撑对试光剂糠离子杂对试脊剂所醒带的糕电荷芳应与遍试样设离子调的电哀荷相惑反流动办相pH使试庄样组乎分与睁离子秩对试俭剂全荷部离裁子化有机绕溶剂养及其交浓度削同一聋般HP疾LC36第三春节友高效罪液相左色谱宇仪组成输液温系统进样督系统色谱例柱系丑统检测南系统数据驶记录港处理但系统37一、系输液皇系统高压爸输液滋泵恒流用泵：宵在输蔬送流挡动相伸过程咸中流登量恒邪定。索常用的柱塞咱往复患泵双泵汁：为关了克贪服流锋量的殖脉动监。桐有涨串联禾式和上并联昌式3839输液情系统输液妹泵应牛具备航的性疮能：流量繁精度棵高且外稳定流量扒范围秆宽能在秋高压渗下连才续工油作液缸沟容积姨小密封长性能飘好，视耐腐厨蚀40输液系系统输液秘泵操稀作注咳意事颗项：防止持固体丝式微粒垄进入确泵体流动匆相不沸应含息有腐处蚀性侄物质防止喇溶剂厌瓶内随的流拦动相佩被用为完不超丈过规危定的横最高鉴压力流动赶相一孕般应骆该先旁脱气41二、售分离看和进钉样系关统进样器进样西阀（尖六通轮阀）夹、自甩动进咏样装伟置色谱蹈柱（co常lu篮mn）由柱饶管和洗固定奸相组垄成分析酸柱、产制备术柱性能跨评价H、n、fs、k和α的重畏复性草，或R。4243三、触检测研系统（一咽）检耽测器(d捉et沫ec铃to纸r)的主犯要性页能要求钞：灵敏昆度（se欧ns孟it贪iv挣it惠y）高（夕检测额限低棍）噪音咐（no压is蒙e）低线性出范围役（li汪ne置ar记r唱an花ge）宽重复缺性（re缓pe碧at抵ab穴il恼it励y）好适用欲范围劝广（起通用熔型、衫专属摧型）44（二槐）紫迎外检块测器(u浇lt腐ra闲vi吓ol处et伶d芹et谅ec缎to捏r)检测两原理子：朗伯天－比榜尔(L载am县be秩rt张-B肥ee僚r)定律定，响牧应信疫号（泼吸光瞧度）饰与浓手度成粉正比A=εC鉴l特点书：灵敏员度较剪高（10-6—1捞0-9g/侍ml），噪音惹低，铁线性趋范围聋宽，腰稳定质性好萍，适培于梯粱度，位不破比坏样傻品，分应用傍广（耗分析阻、制瘦备）转。局限壶：只能惹检测娇有紫其外吸退收的倦物质溜，流无动相崭的截截止波密长应待小于荡检测读波长娇。专属型、文浓度加型检翅测器45紫外线检测情器固定窄波长岗检测粒器视：25独4n纸m可变废波长蹲检测练器：光源杏：氘绕灯（暗和钨夏灯），20触0—生40科0（80鸭0）nm，单色消器，量流通浑池（临试样胀），配光电管光路停系统德和紫勒外分珠光光篇度计蕉相似光电壮二极跟管阵谱列检拔测器(p舰ho销to勿di都od割e反ar皆ra奋y疤de举te案ct机or；PD南AD利)：一系邪列光群电二循极管恩，一个学二极胶管对建应接牺受光停谱上移约1n录m谱带王宽的仅单色表光4647紫外闹检测匪器光电窃二极腐管阵蚊列检且测器工作微原理稀：复挥光通臭过流掏通池劫，再德进入箱单色郑器，柿分光桑后照膝射在制二极侄管阵顿列装疮置上苹，同幸时获岛得各帆波长易的信淡号强镇度，谋即获来得组键分的绸吸收僻光谱秩。获田得三锡维光蠢谱－狼色谱蹦图。用途