兔骨髓间充质干细胞的生物学特征及其对不同生长因子的反应

兔骨髓间充质干细胞的生物学特征及其对不同生长因子的反应【摘要】为了研究兔骨髓间充质干细胞(rBM-MSC)的生物学特征及其对不同生长因子的反应，使用贴壁培养法从兔骨髓单个核细胞中获得间充质干细胞，在光学显微镜和电子显微镜下观察其基本生长行为和生物学特征；使用流式细胞仪检测rBM-MSC的免疫学表型；RT-PCR法检测其胶原表达；诱导rBM-MSC多向分化并使用特异性染色和RT-PCR予以鉴定；最后使用MTT法检测IL-1、3、8和HGF对rBM-MSC生长增殖的影响。结果显示：贴壁生长的rBM-MSC具有典型的成纤维样细胞形态，可传15代以上，第5代rBM-MSC高表达基质受体CD44，低表达造血细胞标记CD45；RT-PCR显示高表达I型胶原，弱表达II型胶原，不表达X型胶原；在不同的诱导条件下，rBM-MSC可被诱导分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和神经元样细胞。rBM-MSC对IL-3最为敏感，10ng/ml的低浓度IL-3可显着促进细胞增殖达32％以上，而高浓度IL-3能显着抑制其生长。结论：分离培养了rBM-MSC，其生物学特征与人和猕猴等BM-MSC相似的生物学特性，低浓度IL-3可有效促进其增殖。

【关键词】骨髓；间充质干细胞；生长因子；兔

BiologicalCharacteristicsofRabbitBoneMarrowMesenchymalStemCellsandTheirResponsetoDifferentGrowthFactors

AbstractThisstudywasaimedtoanalyzethebiologicalcharacteristicsofrabbitbonemarrowmesenchymalstemcells(rBM-MSCs)andtheirresponsetodifferentgrowthfactors.RabbitBM-MSCswereseparatedfrombonemarrowmononuclearcellsbyusingadherentcultivation.Biologicalcharacteristicswereinvestigatedbyopticalandelectronmicroscopy.ImmunophenotypeofrBM-MSCswasmeasuredbyflowcytometry.TheexpressionofcollagenwasdetectedbyRT-PCR.DifferentiationpotentialwasidentifiedbyspecificstainingandRT-PCR.TheresponseofrBM-MSCstoIL-1,3,8andHGFwithdifferentconcentrationsweretestedbyMTT.TheresultsshowedthattherBM-MSCsgaverisetoapopulationofadherentcellscharacterizedbythepresenceofapredominantcelltypewithatypicalfibroblast-likemorphologyandcouldbeculturedforover15passages.CD44washighlyexpressedonF5rBM-MSCs(32%)andCD45waslowlyexpressed(%).TypeIcollagenwashighlyexpressed,whiletypeIIcollagenwaslowlyexpressedandtypeXcollagenwasnotdetectedonrBM-MSCsusingRT-PCRmethod.Invariousconditionsinductingdifferentiation,rBM-MSCscoulddifferentiateintotheosteoblast,chondrocyte,adipocyteandneuron-likecells.TherBM-MSCsweresensitivetoIL-3,evenlowconcentration(10ng/ml)ofIL-3couldpromotetheproliferationofrBM-MSCseffectively(32％,),whereashighconcentrationIL-3inhibiteditsignificantly.ItisconcludedthatrabbitBM-MSCsweresuccessfullyisolatedandculture-expanded.ThebiologicalcharacteristicsofrabbitBM-MSCsaresimilartothoseofhumanandrhesusBM-MSCs.IL-3withlowconcentrationcanpromotetheproliferationofrBM-MSCseffectively,buthighconcentrationofIL-3caninhibittheirproliferation.

Keywordsbonemarrow;mesenchymalstemcell;growthfactor;rabbit

骨髓间充质干细胞具有高度自我更新和多向分化的潜能，在不同的诱导条件下，可分化为多种组织细胞类型，如骨髓基质细胞、成骨细胞、成软骨细胞和脂肪细胞［1］。目前对人和小鼠等物种的BM-MSC

已有深入研究，但对兔BM-MSC的生物学特性，尤其是其免疫学表型和对不同生长因子的反应鲜有报道。兔的形体较大，便于进行移植和观察，对兔BM-MSC的生物学特性进行深入的研究对实验生物学具有重要意义。本研究采用贴壁培养法，在体外培养、扩增兔BM-MSC，对其形态特征、表面标记、多向分化功能以及对不同细胞因子的反应进行初步研究，为以后的移植模型研究奠定基础。

材料和方法

实验动物

3月龄雄性新西兰大白兔6只，体重±公斤/只，购自山东省农科院兔场。

兔BM-MSC的分离培养

对兔按3％戊巴比妥钠1ml/kg体重行耳缘静脉麻醉，无菌取股骨骨髓1ml。用淋巴细胞分离液获得单个核细胞，以4×105/ml的密度悬浮于含10％小牛血清的高糖DMEM中，置100％湿度、5%CO2、37℃条件下培养72小时后全量换液，弃非贴壁细胞，每3天全量换液，约2周后贴壁细胞铺满80％瓶底，用％胰蛋白酶常规消化传代。

电子显微镜观察和细胞组织化学染色

取第5代BM-MSC进行扫描电子显微镜和透射电镜观察，并进行常规碱性磷酸酶染色和糖原染色。

免疫表型检测

取第5代处于对数生长期的BM-MSC，消化后用含％BSA的PBS悬浮，调整密度为1×106/ml，分别标记鼠抗兔CD44、鼠抗兔CD45和鼠抗MHC-I型分子抗体10μl，室温放置30分钟；另取1管作IgG同型对照；以缓冲液洗去未结合抗体，再加入200μlFITC－羊抗鼠二抗，避光孵育20分钟，缓冲液洗去未结合抗体，流式细胞仪检测，结果用CYTOMETER软件分析。

诱导分化及鉴定

成骨细胞取第5代处于对数生长期的BM-MSC，约60％融合时加入成骨细胞诱导培养液，每3天全量换液1次，2周后行碱性磷酸酶染色和茜素红S染色。

软骨细胞取培养第5代处于对数生长期的BM-MSC，约60％融合时加入软骨细胞诱导培养液，地塞米松μmol/L，β-甘油磷酸钠5mmol/L，维生素Cmmol/L，胰岛素2μg/ml，丙酮酸钠30μg/ml，牛血清白蛋白mg/ml，亚硒酸2μg/ml，亚油酸2μg/ml，Sigma公司产品），诱导2周后甲苯胺蓝染色检测胶原表达，RT-PCR检测软骨特异性Ⅱ型、Ⅹ型胶原和aggrecan基因表达。

脂肪细胞取第5代处于对数生长期的BM-MSC，约90％融合时加入脂肪细胞诱导培养液，2周后油红O染色鉴定。

神经细胞取第5代处于对数生长期的BM-MSC，约90％融合时加入预诱导培养液，48小时后加入神经细胞诱导培养液，3天后RT-PCR检测神经细胞特异性nestin和NF-M基因表达，免疫组织化学鉴定神经特异性抗原NSE的表达，一抗为鼠抗兔NSE，二抗为生物素化羊抗鼠IgG。

基因表达的RT-PCR检测

细胞总RNA提取使用TRIzoL试剂(Invitrogen公司产品),反转录按照RT-PCR试剂盒说明书操作。所得cDNA用于PCR扩增，引物见附表:扩增程序为95℃30秒，65℃45秒，72℃45秒，5个循环；95℃30秒，60℃45秒，72℃45秒，20个循环；95℃30秒，55℃45秒，72℃45秒，4个循环；最后72℃延伸10分钟，PCR产物使用2%琼脂糖凝胶电泳分析。

不同细胞因子对兔BM-MSC增殖的影响

取第5代处于对数生长期的BM-MSC，以2000个细胞/孔的密度培养于96孔板中，培养基为含10％小牛血清的高糖DMEM，分别加入不同浓度的IL-1、3、8和HGF，每组设12个复孔，培养48小时后常规MTT法检测MSC对不同生长因子的增殖反应，酶联检测仪(INTEC公司产品，Reader2010型)检测492nm处吸光值。Table.Primersequence

统计学处理

计量数据用X+SD表示，组间差异分析用t检验,认为差异有显着统计学意义。

结果

细胞形态及特异性染色

兔骨髓单个核细胞在贴壁培养72小时后可见少量细胞贴壁，10天后BM-MSC能铺满80％瓶底，以成纤维样细胞为主，HE染色可见核内有2-4个明显核仁；扫描电子显微镜下可见大部分细胞表面光滑，少数梭形细胞有丰富的表面片状皱褶；透射电子显微镜观察显示，膜光滑有少量微绒毛的成纤维样细胞占大多数，该细胞核与细胞质比约为1∶5，细胞核中常染色质丰富、分布均匀，图1C可见双核仁，核仁大而结构清晰，核膜完整，可见内质网、高尔基复合体、线粒体、溶酶体和一些髓鞘样小体，胞质中分别有大量核糖体和微丝。BM-MSC细胞膜微绒毛较多，靠近这些突起的细胞质中分布有致密的微丝，形成一条高电子密度带。细胞化学染色2%-3％的细胞碱性磷酸酶阳性，在胞质内有红棕色沉淀，阳性细胞在形态上与阴性细胞没有差异；糖原染色全部细胞均为阳性，胞质含大量紫红色糖原颗粒。

诱导分化结果及其鉴定

加入成骨细胞诱导培养液2-3天后，细胞开始从长梭形缩短为多角形，细胞体积增大，诱导14天后茜素红S染色为阳性，碱性磷酸酶阳性细胞大幅增加，表现出成骨细胞的特点；加入软骨细胞诱导培养液后，细胞由长梭形显着缩短为椭圆形，体积增大，甲苯胺蓝染色呈阳性。RT-PCR结果表明其表达软骨细胞特异性的aggrecan基因，Ⅱ型胶原的基因表达也较诱导前增多，表现为软骨细胞分化的特点；但Ⅹ型胶原不表达；成脂肪细胞诱导后细胞胞浆内开始出现细小脂滴，细胞排列无序，显微镜下可观察到高折光性的脂滴。油红O染色显示脂肪细胞内大量的大颗粒状脂滴；神经预诱导剂加入后细胞形态变得细长，加入二次诱导剂后6小时内约有60％的细胞死亡脱壁，剩余的细胞有50％表现为神经元样细胞特有的形态，伸出细长的伪足。这些细胞表现为NSE免疫组化染色阳性；RT-PCR结果显示其表达神经细胞特异性基因Nestin和NF-M。

细胞表型及RT-PCR检测

兔BM-MSC细胞上CD44抗原表达阳性率为32％；CD45表达阳性率为％，MHC-Ⅰ型分子表达阳性率为％；流式细胞仪测定结果见图3A-D。RT-PCR显示第5代的兔BM-MSC高表达Ⅰ型胶原，弱表达Ⅱ型胶原，不表达X型胶原、aggrecan、nestin和NF-M基因。

不同细胞因子对兔BM-MSC增殖的影响

酶联检测和MTT结果显示，兔BM-MSC对IL-1、3、8和HGF的反应模式基本相同，均为低浓度促进兔BM-MSC的增殖，高浓度反而抑制细胞生长，抑制效应随细胞因子浓度增加而增加；兔BM-MSC对IL-3的反应最为明显，10ng/ml的IL-3可显着促进细胞增殖达32％以上，而高浓度的IL-3对兔BM-MSC的抑制效果也较其它因子明显。

讨论

目前分离MSC的方法多基于其黏附贴壁和体外快速增殖能力，鉴定MSC则主要是根据其形态和功能。目前普遍认为BM-MSC表达CD13、CD29、CD44、CD59、CD105、CD166和HLA-ABC，不表达CD11、CD14、CD31、CD34、CD45、CD80、CD86、CD117和HLA-DR［2］。由于兔基因组计划尚未完成，兔分化抗原的抗体难以得到，本实验仅能选择CD44和CD45。细胞黏附分子CD44属于基质受体，是分布极为广泛的细胞表面单链穿膜糖蛋白，在淋巴细胞、成纤维细胞和上皮细胞表面均能检测到它的表达，专一性结合透明质酸盐并介导其内吞，在细胞-细胞和细胞－基质间作用中发挥重要作用［3］。我们的实验结果显示，约1/3的兔BM-MSC表达CD44，与猕猴BM-MSC的数据相同［4］，但较人BM-MSC的数据为低［5］，这证明了物种间存在差异。我们培养得到的兔BM-MSC高表达I型胶原，弱表达Ⅱ型胶原，不表达Ⅹ型胶原和aggrecan基因。胶原是细胞外基质的主要成分之一,目前已发现19种胶原分子,I型胶原的分泌是MSC的标志之一，可有效地促进BM-MSC的黏附、增殖和分化［6］，有关报道证明，如将人BM-MSC向软骨细胞方向诱导分化，则aggrecan基因、Ⅱ型胶原和Ⅹ型胶原的表达就会显着增加［7］，我们的试验结果显示，将兔BM-MSC向软骨细胞方向诱导分化后，表达aggrecan基因和Ⅱ型胶原，而不表达Ⅹ型胶原，这与人BM-MSC数据有差异。兔BM-MSC除向软骨细胞分化以外，我们还成功地使其诱导分化为骨细胞、脂肪细胞和神经元样细胞，证明了其具有多向分化潜能。骨髓中BM-MSC的含量仅占1/106个有核细胞，并且随着年龄的增加或体质的衰弱，BM-MSC的数量逐渐减少［8］。因此要获得足量的MSC，大量扩增纯化是十分必要的。根据我们的实验结果，第5代之前的兔BM-MSC具有旺盛的增殖速度，倍增时间约为40小时，细胞形态狭长；从1ml骨髓中获得的BM-MSC传代7-8次所得细胞数目可达5×108，已经能够足够满足体内移植和一般实验研究所需。随着重复传代，细胞变得宽大，生长速度下降，这和人BM-MSC中的研究结果相似，随着BM-MSC的衰老，其对生长因子的反应能力和多向分化能力也会显着下降［9］。BM-MSC除表达IL-6、IL-8、IL-11、IL-12、IL-14、IL-15、LIF、G-CSF、GM-CSF、M-SCF、FL和SCF等多种细胞因子外，还能对bFGF、BMP、胰岛素、TGF-β1和HGF等多种细胞因子作出增殖或分化响应，证明其表达多种因子受体［11-13］。本实验检测了不同浓度的人IL-1、3、8和HGF对兔BM-MSC生长的影响。结果显示，低浓度的人IL-1、3、8和HGF能促进兔BM-MSC的增殖，而高浓度则抑制其增殖，其中低浓度IL-3对兔BM-MSC的促增殖作用最为显着，而高浓度的IL-3的抑制效果也较其他细胞因子明显。BM-MSC本身不表达IL-1和IL-3［11，13］，IL-3主要由活化的T细胞产生，而IL-3受体主要表达于造血细胞上并介导造血细胞的增殖、分化或激活。有文献表明，人脐静脉内皮细胞也表达IL-3受体，并可被TNF或IFN上调。混合IL-3和IFN可上调脐静脉内皮细胞表达MHCII类分子并分泌IL-6和G-CSF等造血生长因子［14］。根据我们的结果，IL-3受体也表达于BM-MSC，IL-3可能通过IL-3受体促进BM-MSC的增殖并使其表达

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