杨梅素分散片对大鼠实验性脑缺血的保护作用及对血栓形成的影响

杨梅素分散片对大鼠实验性脑缺血的保护作用及对血栓形成的影响【摘要】目的研究杨梅素分散片对大鼠实验性脑缺血的保护机制及对血栓形成的影响。方法采用双侧颈总动脉结扎法制备大鼠实验性全脑缺血再灌注损伤模型，通过测定大鼠脑含水量，超氧化物歧化酶、单胺氧化酶(MAO)的活性和丙二醛(MDA)、乳酸(LA)的含量，观察杨梅素分散片对大鼠实验性脑缺血的影响；采用体内静脉血栓形成法,观察杨梅素分散片对体内静脉血栓形成的影响；并研究其对血小板聚集的影响。结果与模型组相比，杨梅素分散片各剂量组(140，70，35mg/kg)均可显着改善脑水肿、减少过氧化脂质的形成，减少乳酸的聚积，并对单胺氧化酶有抑制作用；显着减轻大鼠静脉血栓重量；显着抑制ADP诱导的血小板聚集。结论杨梅素分散片对大鼠实验性脑缺血具有明显保护作用，并有明显抗血栓形成作用，机制可能与其抑制脂质过氧化物损害及提高抗氧化酶活性、改善凝血状态、抑制血小板依赖性血栓的形成有关。

【关键词】杨梅素分散片；实验性脑缺血；血栓形成；血小板聚集

Abstract：ObjectiveToinvestigatetheeffectofMyricetinDispersibleTabletsonexperimentalcerebralischemia-reperfusioninjuryinratsandthrombosiscerebralischemia-reperfusioninjurymodelwasinducedbyligationbilateralcommoncarotidarteries.Theprotectiveeffectofmyricetindispersibletabletswasobservedbydetectingthecontentofcerebralwater,SODandMAOactivities，MDAandLAcontents.ResultsIncontrastwithmodelgroup,MyricetinDispersibleTablets((140mg/kg，70mg/kgand35mg/kg))couldsignificantlydecreasethecerebralwatercontent,MDAandLAcontents,aswellastheweightofvenousthrombus,suppressMAOactivity,andsignificantlyincreaseSODactivity.ConclusionMyricetinDispersibleTabletsmayprotectcerebrumfromischemicinjurybysuppressinglipidperoxidation,increasingantioxidaseactivity,suppressingplateletaggregationandthrombusformation.

Keywords：MyricetinDispersibleTablets;Experimentalcerebralischemia;Thrombosisformation;Plateletaggregation

杨梅素(myricetin)，又称杨梅树皮素，是一种天然黄酮醇类化合物，为杨梅树皮的主要化学成分，也是广西藤茶中的主要有效成分之一，并广泛存在于许多天然植物、水果和茶叶中。近年来研究发现，杨梅素可抑制血小板活化因子介导的兔血小板聚集、5-羟色氨释放及血小板内钙离子浓度升高,从而起到保护心血管的作用，且实验结果表明其抗PAF作用比传统活血化淤中药红花的有效成分羟基红花黄色素Ａ作用强，其作用机理与PAF受体拮抗剂银杏总内酯相似，可作为一种新的PAF受体拮抗剂［1］。目前,美国InternationalFoodInformationCouncilFoundation已将杨梅素列为功能性食品，并应用于医药、食品、保健品和化妆品中。杨梅素分散片是我们课题组正在研究的新药制剂，它是用从广西藤茶中提取得到的杨梅素为主要原料研制而成的。本实验旨在研究杨梅素分散片对实验性脑缺血的保护作用及对体内血栓形成的影响，为其新药开发和临床应用提供科学依据。

1器材1药物杨梅素分散片，于广西中医学院制剂教研室制备，批号060820，实验时用蒸馏水研磨配制成不同浓度药液备用；复方丹参片，安徽华陀国药厂产品，批号20060512；阿司匹林，湖南新汇制药有限公司产品，批号060602；盐酸肾上腺素注射液，天津药业集团新郑股份有限公司产品，批号070401。2试剂超氧化物歧化酶测试盒，批号20070315；丙二醛测试盒，批号20070316；单胺氧化酶测试盒，批号：20070320；乳酸测试盒，批号20070317；总蛋白测试盒，批号20070319。均为南京建成生物工程研究所生产。二磷酸腺苷，上海国药集团化学试剂有限公司产品，批号20060624。3动物KM种小鼠，18～22g；Wistar种大鼠，体重200～250g。清洁级，由广西医科大学实验动物中心提供，许可证号SCXK桂2003—0003。动物按性别分笼饲养于有空调的实验动物室内，室温(22±1)℃,相对湿度(60±5)%。自由饮水和喂标准颗粒饲料。4仪器电热水浴恒温箱，上海医疗器械三厂生产；722型光栅分光光度计，上海第三分析仪器厂生产；MDK-3200型全自动血流变测试分析仪,重庆麦迪克科技开发有限公司产品；BS631型血小板聚集仪，北京生化仪器厂生产；美国PELambda12型紫外分光光度计。

2方法

杨梅素分散片对大鼠急性脑缺血再灌注损伤的保护作用

剂量设置与分组根据预试验结果及临床常用剂量，杨梅素分散片高、中、低3个剂量组分别为140，70，35mg/kg，阳性对照组为g/kg，采用与临床用药途径一致的方式灌胃给药。Wistar大鼠60只，雌雄兼用，随机分为6组：假手术组、模型组、复方丹参片及杨梅素分散片大、中、小剂量组。

模型建立参照文献方法［2］，大鼠用10％水合氯醛3ml／kg体重腹腔注射麻醉，颈正中切口，分离、动脉夹结扎双侧颈总动脉。缺血1h后经灌胃给药或溶剂对照。继续缺血1h后解除动脉夹实施再灌注，血流再通，缝合切口，自由饮食饲养24h。假手术组除不结扎血管外，其余步骤同上。

取样与指标测定［2］大鼠连续5d灌胃给药，1次／d。第5天制造急性脑缺血模型，24h后开颅取脑，以滤纸吸干表面残血，去除嗅脑、脑干、小脑。各组取右半脑组织标本称脑组织湿重，再将其置于120℃电热恒温箱中48h后称取干重，按公式计算脑组织含水量：脑组织含水量(％)=(湿重-干重)／湿重×100％；各组余下左半脑组织标本分别置于玻璃匀浆器，按质量与体积比为1：9比例冰浴下以冰生理盐水制备成10％的脑组织匀浆，立即放入-30℃冰箱中保存。按照试剂盒说明书要求，取样品采用722型光栅分光光度计和紫外分光光度计分别测定大鼠脑组织中SOD活性，MDA、LA含量及MAO活力。并用血清总蛋白试剂盒测定脑组织蛋白含量。

杨梅素分散片大鼠体内静脉血栓形成的影响［3］取Wistar大鼠50只，雌雄各半，体重200～250g，随机分为空白对照组，复方丹参片组,杨梅素分散片高、中、低剂量组，每组10只。各组均灌胃相应药液，1次/d，连续7d，末次给药后1h，大鼠以10％水合氯醛腹腔注射麻醉，于腹中线切开皮肤约3cm，分离下腔静脉，于左肾静脉下方用粗线结扎下腔静脉，缝合腹壁。4h后，重新打开腹腔，在结扎下方2cm处夹闭管腔，将该段管腔内血液吸尽，剖开管腔，取出血栓，放在滤纸上，吸干血液，用微量电子天秤称取血栓湿重(mg)。以血栓重量为评价指标，测定各给药组对静脉血栓形成的影响。

对体外ADP诱导大鼠血小板聚集的影响［4］取体重200～250gWistar大鼠，用10％水合氯醛3ml／kg体重腹腔注射麻醉后，剖开腹腔，从腹主动脉取血，注入盛有%枸椽酸钠溶液试管中，轻轻摇匀，以1000r/min离心5min，吸取上清液为富血小板血浆，剩余血继续以3000r/min离心10min，吸取上清液为贫血小板血浆。将BS631型血小板聚集仪打开，预热30min后，用PRP调零，用PPP调幅度。测定时对照管取PRPml及生理盐水20μl，给药管取mlPRP及药液20μl放入比浊管中，在37℃恒温及1300r/min搅拌条件下加入ADP50μl(50μg/ml)，用自动平衡仪以20mm/min纸速记录对照管和给药管血小板聚集曲线，根椐所记录的曲线计算血小板聚集百分数。

统计方法采用统计软件分析数据。所得实验数据用±s表示，采用t检验作组间比较差异显着性。

3结果

杨梅素分散片对大鼠急性脑缺血再灌注损伤的保护作用

对脑缺血再灌注损伤后脑组织含水量的影响实验结果表明，与假手术组比较，模型组脑含水量明显增加(P0．05)，表明脑缺血再灌注有脑水肿的发生。杨梅素分散片各剂量组均能明显降低脑组织含水量，与模型组相比差异显着(P0．01或P0．05)。结果见表1。

表1杨梅素分散片对脑缺血再灌注损伤后脑组织含水量的影响

与假手术组比较，#;与模型组比较，*;**

对脑缺血再灌注损伤脑组织SOD活性及MDA含量的影响与假手术组比较，模型组脑组织SOD活性明显降低，MDA含量明显增加(P0．05)，表明脑缺血再灌注伴有脑组织自由基的聚积以及抗氧化酶活性的降低。与模型组比较，杨梅素分散片各剂量组均能明显升高脑组织中SOD活性，降低MDA含量，提示杨梅素分散片具有抗氧化作用。结果见表2。

表2杨梅素分散片对脑缺血再灌注损伤后脑组织SOD活性及MDA含量的影响

与假手术组比较，#;与模型组比较，*，**

对脑缺血再灌注损伤脑组织LA含量及MAO活力的影响与假手术组相比，模型组脑组织LA含量及MAO活力有显着增加()，表明脑缺血再灌注时脑组织伴有LA聚积并可能由于大量过氧化氢(H2O2)的产生增强了MAO的活性。杨梅素分散片各剂量组均能显着降低LA含量及MAO活力，与模型组相比有显着差异(P0．05)。结果见表3。

表3杨梅素分散片对脑缺血再灌注损伤后脑组织MAO活性和LA含量的影响

与假手术组比较，#;与模型组比较，*，**

杨梅素分散片对大鼠体内静脉血栓形成的影响与空白对照组比较,杨梅素分散片各剂量组和复方丹参片组能明显减少大鼠体内静脉血栓湿重,提示杨梅素分散片具有抗大鼠体内静脉血栓形成作用。结果见表4。

表4杨梅素分散片对大鼠体内静脉血栓形成的影响

与空白对照组比较，*，**；n=10

对体外ADP诱导大鼠血小板聚集的影响与空白对照组比较,杨梅素分散片高、中、低剂量组和复方丹参片组均能明显抑制大鼠血小板聚集率，结果见表5。

表5杨梅素分散片对大鼠血小板聚集的影响

与空白对照组比较，*，**;***；n=10

4讨论

脑缺血是较常见的脑血管系统病症，涉及多个病理生理环节。恢复脑缺血后血流供应是临床治疗重要环节。大量实验研究表明［5，6］，缺血后再灌注可产生大量自由基，破坏组织结构而加重组织损伤，因此，防治脑缺血再灌注损伤的重要措施之一就是抗自由基对脑组织的毒害作用。此外，当脑缺血发作时，脑细胞生物氧化功能发生异常，产生大量自由基，生成大量的脂质过氧化物，其中最主要的是MDA，因此MDA含量可反映其损伤程度；NO本身也是一种自由基，有研究表明，适量的NO对脑有保护作用；但脑缺血后期或再灌注时NO的增高则会扩大缺血面积,加重脑水肿及神经细胞的损伤。当脑缺血损伤时，MDA和NO参与了损伤过程,而SOD作为体内重要的氧自由基清除剂,在保护细胞不受毒性自由基的损伤方面发挥着重要的作用。因此SOD活性的大小可以反映机体抗损伤及抑制细胞凋亡的程度。

本实验研究结果显示，脑缺血再灌注可导致内源性抗氧化酶系统功能降低而过氧化脂质增加，产生严重的脑水肿，并伴有严重的能量代谢障碍，脑组织中MAO活性增加，LA大量聚积，造成脑组织的损伤，明显影响大脑的正常功能。由实验结果可见，杨梅素分散片可提高SOD活性,减少MDA含量,显着改善急性脑缺血大鼠的脑水肿、减少过氧化脂质的形成，减少乳酸的聚积，并对单胺氧化酶有抑制作用，从而减轻了氧自由基对脑组织的毒害，证明本药物具有清除自由基及抗脂质过氧化的作用,对大鼠急性脑缺血及再灌注损伤确有保护作用。

血栓形成是脑缺血性疾病的主要致病因素之一，是脑卒中、冠心病、动脉粥样硬化等致残和致死率高的心脑血管疾病的主要病理学