测序原理及特点课件

3730xl测序仪的原理

双脱氧链终止法测序原理

3730xl测序仪的构造

3730xl测序仪的特点

测序基本流程3730xl测序仪的应用文库类型及特点Sanger测序法的原理

1977年，英国人FredSanger发现，如果在DNA复制过程中掺入ddNTP，就会产生一系列末端终止的DNA链，并能通过电泳按长度分辨。不同末端终止DNA链的长度是由掺入到新合成链上随机位置的ddNTP决定的。由此诞生了以Sanger命名的测序原理即双脱氧链终止法测序原理。DNA测序的双脱氧链末端合成终止法. Sanger法测序的原理：用DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物，直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3‘-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止，终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段进行检测。5´磷酸3´羟基3´,5´-磷酸二酯键核苷酸形成3,5-磷酸二酯键示意图核酸序列形成的基础“双脱氧末端终止”的含义原理:在一端引物上标记特定的荧光,通过PCR产物长度大小，检测基因型.内标选择:1、荧光.(引物上物加的荧光的类型)Liz500：FAM(蓝色),VIC(绿色),NED(红色),HEX(黑色)Liz120；ROX500(FAM,JOE,NED,PET)2、目的片断的大小.Liz500(35-500bp),Liz120(15-120bp)TemplatePrimerdNTPPolymeraseTerminatorCGTA终止物标记方法因为颜色不同，4种终止物可以在一起进行反应。模板DNA引物primerdATP,dTTP,dCTP,dGTP带荧光标记的ddNTPSanger测序——双脱氧末端终止法ddNTP被加到正在合成的链上，由于它的3’-OH已被氧化，下一个dNTP的5’-磷酸基团不能与之形成磷酸二酯键，使合成终止。在引物等延伸反应过程中，ddNTP在不同位置掺入，产生了一系列不同长度的新的DNA片段。5’3’5’3’3730xlSequenceMap测序反应与PCR的比较

PCR测序反应

DNA聚合酶Taq酶测序酶引物一对单向底物dNTPdNTP+ddNTP*

模板量少质量要求高产物等长的DNA片段相差一个碱基的一系l列片段荧光标记无3’端带荧光标记测序产物指数扩增线性扩增3730xl测序仪的构造

遗传分析仪系统组成主机电脑及软件耗材照明灯开关状态指示灯电源开关进样器按钮Buffer槽Water槽样品舱门指示灯Waste槽加热炉门样品仓门灌胶泵系统加热炉泵胶块胶管胶瓶阳极缓冲液杯下胶块连接管毛细管

加热炉内仓96道毛细管同时检测Capillary3730XL测序原理3730xl测序仪的特点

1电进样及电泳用“电进样”的方法将带电的样品分子加到灌好电泳胶的毛细管的进样端（负极）。然后在毛细管两端加上直流电压，样品中不同大小的DNA片段开始由负极向正极移动，移动的速度受到片段自身大小的影响，片段越短移动的越快。电泳的结果是使长度不同的带电DNA片段互相分离，并且按片段的长短的顺序通过检测窗口，产生信号，短片段先达到检测窗口。2荧光激发和检测分别带4色荧光标记的DNA片段 从小到大依次经过激光检测区2. 激光激发荧光 产生长波长的荧光信号3. 荧光信号被冷CCD收集4. 软件将光学信号转换成电泳图谱

检测窗口双束激光激发负极正极

光栅全波长分光低温CCD实时检测电泳方向大小相差1bp的带荧光标记的DNA单链激发：DualSideIllumination

双束激光两侧同时激发：灵敏度+均匀性+超速测序TopbeamBlockedBothBeamsBottomBeamBlocked检测：光栅+低温CCD

同步成像支持4色或5色以上荧光，适用于多种商品化试剂盒。更新荧光化学时无需更换任何硬件设备低温CCD有效提高信噪比，准确度高。光栅全波长分光低温CCD实时检测CCD检测器把检测到的荧光信号转换为电信号，并把它传送给安装了DataCollection（简称DC）DC接收到信号后，用预先设置好的方式进行初步处理，并把这些数据存贮在计算机的数据库里DC会自动地从数据库中提取这些数据，并根据不同的运行模式，完成对样品DNA的碱基序列或片断信息的分析，然后把分析完成后的结果数据以样品文件的形式保存于计算机的硬盘中FullyIntegratedSystem3730xl型遗传分析仪双光束激光实时激发荧光全波长实时荧光检测：光栅分光，后置超簿型CCD检测96个样品自动进样及一体化16板自动进样样品架内置样品板条形码自动识别100次（9600个样品）运行试剂一次上机自动碱基识别与质量评分软件长读测序POP-7液体分离胶，动态内镀毛细管电泳温度18-70

C可调DNA测序基本流程

准备模板：质粒、PCR产物抽样检查DNA浓度和质量，必要时纯化测序PCR反应纯化测序产物变性上机电泳分析数据DNA测序技术应用测序的应用

基因组DNA测序cDNA测序未知序列测序已知序列再测序质粒、PCR产物BAC、YAC细菌基因组DNA法医：线粒体DNA测序LongreadwithBigDye®Terminatorv3.1:>1010bp长片段测序ACCGTCTTGACCTCGTACGCATGAACCGTCCTGACCTCGTACGCATGA基因测序的重要工作：杂合子位点识别ACGT杂合子测序杂合子检测：发现新突变位点再测序人类基因组计划的完成，为遗传分析开创了新的研究领域其他物种的测序项目已经启动再测序项目的特点可以更好的理解遗传多样性在疾病中的作用可以在各种规模的实验室中进行，而不是仅限于基因组测序中心要求更高质量的数据基因分析技术

在生物、医学、农牧业领域的应用

DNA测序

人类功能基因再测序细菌、真菌等微生物鉴定；HLA配型基因突变检测

SNP检测SNaPshotMultiplexSNPlex二重TaqMan探针片段分析基于STR的法医个体识别与亲子鉴定：HID基于STR的致病基因连锁定位：LMS基因突变筛选

：SSCP农牧业育种：AFLP

基因表达定量TaqMan探针法与荧光染料法STR遗传标记基因分型CNV遗传标记在MLPA反应的结果原理：单碱基延伸,单碱基测序.利用延伸引物对PCR产物进行单个碱基的延伸,并引入尾部的荧光.其荧光的颜色及其荧光出现的位置进行区分其基因型SnapSHot技术优点：可以研究样本量少,snp位点多,位点间物理距离较远的SNP检测.SNP遗传标记在SnapSHot反应的结果5417G663A13010G4216T4491C10646G11719A4715T4833T12406G5301T13263A7028T14569G12705T15607A9824A5178A3010T文库类型及特点基因文库（GeneLibrary）基因组文库（GenomicLibrary）cDNA文库（cDNALibrary）基因组文库含有某种生物全部遗传信息的重组DNA分子的克隆总和基因组文库常用的载体及特点质粒载体

简单、快速、易于操作，但仅适合一些低等真核生物和原核生物，如：pBR322,pUC18,pGEMλ噬菌体载体

由λ噬菌体改建而来，需要在体外包装成噬菌体颗粒，再转染受体细胞粘质粒载体（cosmid)

具有质粒和λ噬菌体两种载体的性质人工染色体

能容纳大片段的外源DNA。如YAC(酵母人工染色体），BAC(细菌人工染色体），PAC(P1来源的人工染色体），MAC（哺乳动物人工染色体）各种克隆载体的比较载体受体细胞结构插入大小适用pUC18/19质粒E.coli环形质粒<10kb亚克隆文库λ噬菌体E.coli线性载体~24kb基因组文库粘质粒E.coli环形质粒35~45kb基因组文库BACE.coli环形质粒100~300kb基因组文库PACE.coli环形质粒100~300kb基因组文库YAC酵母细胞线性染色体100~2000kb基因组文库MAC哺乳类细胞线性染色体>1000kb基因组文库cDNA文库直接以完整的mRNA为模板反转录成的全长cDNA分子与克隆载体连接后，转导到寄主细胞，经复制形成的在寄主细胞中保存的许多克隆

分类质粒cDNA文库噬菌体cDNA文库

表达文库非表达文库未处理cDNA文库均一化cDNA文库差减cDNA文库普通cDNA文库应用领域发现SNP

克隆新基因基因表达谱分析从EST中发掘SSR标记

挖掘与病害、发育等功能相关的关键基因开展转基因等功能研究，以改变某生物的性状。保护濒危珍惜生物资源，建立该生物的基因库。EST可以作为构建分子标记连锁图谱所用的探针普通cDNA文库构建基本流程双链cDNA末端的磷酸化及酶切提取totalRNA分离mRNA合成一链cDNA

合成二链cDNA双链cDNA末端补平加接头胶回收cDNA连接电转化鉴定库容及插入子大小文库送检1d1d1d1d2d4d建立cDNA