第三章免疫学检测技术

第三章免疫学检测技术韶关学院生科院易道生内容掌握抗原抗体反应的原理与特点，了解抗原抗体结合力和比例。掌握免疫组化（IHC）的原理和方法，熟悉一抗、二抗的选择与使用。掌握酶联免疫检测（ELISA）反应的原理方法。掌握免疫印痕（Westernblot）的技术原理与方法。了界放射免疫检测技术（RIA）的原理与方法。目标：掌握ELISA、IHC、Westernblot的操作方法免疫学检测技术就是利用抗原和抗体高度特异性结合的原理和方法，检测分析各样品中的目标物质，以监控物品质量、检测机体免疫机能和诊断某些疾病的体外检测方法。免疫检测是微量检测方法，灵敏、特异。随着方法和技术的改进，免疫检测方法已渗入工、农、食品、医药等各个领域。从20世纪50年代美国学者Berson和Yallow发明了放射免疫测定技术检测胰岛素起，免疫学检测技术经历了从定性到定量；从常量分析到微量、超微量分析；从手工检测到全自动化；从单个标本检测到高通量检测等一系列长足的进步。本章主要学习血清学检测方法——抗原抗体检测方法。年代学者贡献1894J.Bordet补体与溶菌活性1896H.Durham,M.vonGruber特异凝集反应1896G.Widal,A.Sicad肥达试验1897R.Kraus沉淀试验1900J.Bordet,O.Gengou补体结合反应1900K.Landsteiner人类ABO血型及其抗体1906A.Wassermann梅毒补体结合反应1935M.Heidelberger,F.Kendall纯化抗体,定量沉淀反应1941A.Coons免疫荧光标记1946J.Oudin凝胶内沉淀反应1948O.Ouchterlony,S.Elek双扩散沉淀反应1953P.Grabar,C.Williams免疫电泳分析,Ig多样性1960R.Yallow,S.Berson放射免疫标记1966S.Avrames,J.Uriel,etal酶标免疫技术1975G.Kohler,C.Milstein杂交瘤技术与单克隆抗体免疫学技术的发展史第一节免疫学检测的基本原理抗原抗体反应指抗原与相应抗体间的特异性结合反应。曾叫血清学反应。

抗体结构CCFcFabNNNNCC一、抗原抗体的特异性结合抗原抗体的结合反应，在体内可介导溶细胞效应、溶菌、中和病毒、促吞噬作用，形成一整套机体体液免疫功能。体外反应有凝集作用、沉淀作用、调节作用、中和作用等。1、抗原抗体的互补性和亲和性抗原抗体的结合是基于抗原决定簇（表位）与抗体超变区分子间的互补性和亲和性。互补性指抗原表位的空间结构与抗体分子超变区内的抗原结合位点间的空间结构互补嵌合。亲和性指抗体分子上的抗原结合位点与相应抗原表位间互相适应产生的吸引力。互补性是Ag和Ab结合的基础，亲和性是Ag和Ab间固有的作用力。2、抗原抗体结合力抗原和抗体分子的结合可以是游离形式的，也可以结合在细胞表面。这种结合也是非共价键结合。抗原与抗体相互结合只局限于分子表面的特定部位，即抗原决定簇和抗体结合位点之间，且以亲和力的作用方式结合在一起。由这些特定部位之间的短程分子力相互作用的结果。这些吸引力只有在极短的距离内才有效。因此抗原决定簇与抗体结合位点在空间上必须处于紧密接触状态，才能产生足够的结合力。这种分子间的互补结构决定了抗原抗体结合的专一性。抗原抗体间的作用力有：抗原抗体分子间的作用力，即亲和力包括以下几种：1、盐键（离子键）2、范德华力3、疏水作用4、氢键3、亲水胶转化为疏水胶抗体和大部分抗原在溶液中是亲水胶，不会聚沉。一旦破坏电荷和水化层，如Ag+Ab，减少电荷，由亲水胶转化为疏水胶，形成可见的Ag–Ab复合物沉淀。利用此沉淀反应可检测相应的抗原或抗体。二、抗原抗体反应的特点1、特异性抗原与抗体相互结合必须有空间构型的互补性，因此，有很强的特异性。但，如果两种抗原存在相同（似）的表位，或抗原、抗体间构型有部分或全部相同，就可能出现交叉结合——凝集或沉淀。既可能干扰实验，也可以用于扩大应用范围。2、比例性抗原（多价）抗体（2价或以上）不等价性，使抗原抗体反应时存在比例关系，生成物的量与反应物的量（浓度）有关。比例性：抗原抗体结合生成复合物的量与反应物浓度的关系。只有2者分子比例合适，结合价相互饱和，才生成可见的复合物。在等价带区的溶液中几乎不存在游历的抗原和抗体。滴度（效价）指抗原或抗体与一定量的对应物产生明显可见的反应所需的最小量。抗原践抗体稿反应点的等暴价带也（zo胃ne策o余f杠eq糟ui烧va胳le震nc圾e）：曲线芦的高裂峰部爬分，惑抗原床抗体桂分子县比例很合适伞的范稼围。在此唯范围恋内，极抗原限抗体悉充分直结合铜，沉庙淀物茄形成鞋快而杯多。最适救比（op忘ti义ma则l垮ra占ti机o）：其中菊有一追管反阻应最本快，捐沉淀座物形辩成最碎多，捞上清字液中北几乎购无游来离抗捉原或怕抗体么存在内，表回明抗懒原与伟抗体灯浓度劲的比认例最把为合昆适。带现停象（zo匹ne较p赶he伤no巴me突no白n）：等价纷带前榜后分隙别为园抗体含或抗航原过蜜剩则夺无沉阅淀物资形成。前带登（pr孝ez吴on皇e）：抗体傅过量后带符（po追st判zo扒ne）：抗原乐过剩。抗原夏抗体乖比例炒对反革应现铸象的逃影响3、可挑逆性抗原纯抗体丢的结配合反炒应是支一个耍可逆意的反差应。Ag督+AbAg教-Ab高亲遇和力使抗原济表位炸和抗首体超燥变区迁的构聚型非袄常适浆合，子结合博牢固虑，不樱易解晴离。开解离该取决些于：抗体昼对相在应抗龄原的短亲和娘力环境付因素聋对复嫂合物鞠的影当响当抗齐体与番抗原贺结合咬时，宇如果础是颗送粒抗遇原，呼则出撕现凝册集现证象；外如果谢是可替溶性串抗原滑，则盛产生吃沉淀脱作用吵。4、阶度段性抗原袖抗体稿反应肃被人笨为分倒为2阶段检。结合馋阶段蓬：当抗弯原与宽同型担抗体霞相遇挂时，熔在合骂适条横件下允，不行论彼摧此量挤的多僚少，烈都立短即发抹生特沃异性胜的结拔合形排成抗史原抗冲体复它合物杨，这极一过漂程通牲常只谦需要诵几秒郑的时准间便堡可完竿成，阁称为纽奉反应足的一擦级阶堪段。反应窗阶段估：在一泡级阶掏段之滚后，必继发舟出现易抗原评与抗封体间帝进一佛步交株联而运形成印网络包状凝域集物递，进膊而出虫现可陆见的替凝集炕和沉蛋淀，借称为揭反应蹈的二培级阶游段。俭这一驳阶段鸡是抗睛原抗驶体网胜格生鱼长的火阶段难，速鄙率要改慢的旷多，陕且在营很大烫程度合上依窑赖于欠温度砍、离深子强伏度等堤外界挣条件斤，但祝更重虑要的困是需群要合烟适的世抗原百抗体考分子虽比例疤。只晴有当机二者坝的结备合价朱彼此辅饱和眼时，凶才能万连接欺成一胸个大滤网格路样凝厉集物混，出础现凝楚集或售沉淀养。三、畜影响岛抗原市抗体扔反应饥的因肿素抗原业抗体冬自身桌因素抗原毫：理如化性滨状墙决定侄簇种德类和酸数量抗体抄：来源峰：惕兔等凑，良马愚、人贵单克乒隆抗算体浓度特异以性和县亲和方力2环境盾因素电解蜓质Na+和C1－，可分姓别中劳和胶棒体粒祝子上出的电影荷，修使胶捕体粒伪子的身电势恐下降咏，促套使抗剧原抗霉体复业合物往从溶稍液中纯析出趣，形员成可毯见的胸沉淀浆物或铲凝集象物。酸碱更度抗原最抗体匠反应裂一般票在pH为6～8进行葵。PH过高者或过期低都病将影揭响抗由原与仰抗体翅的理碗化性妨质，年例如pH达到洞或接僵近抗烈原的自等电平点时疲，即沿使无荣相应析抗体编存在忧，也边会引锯起颗胸粒性调抗原尚非特弄异性百的凝文集，惰造成辅假阳姓性反炮应。温度温度绳升高奴可加竹速分竹子运凡动，郊抗原章与抗虹体碰葬撞机牺会增右多，气使反什应加怕速。勿但若骗温度她高于56周℃时，巧可导开致已裁结合头的抗怒原抗友体再鲁解离奶，甚制至变笑性或补破坏佛；在40赶℃时，开结合剥速度爪慢，菊但结第合牢虏固，衰更易竟于观抹察。演常用袖的抗售原抗童体反罚应温淡度为37瓦℃。适当孟振荡/搅拌可促涨进抗手原抗息体分疾子的找接触情，加悼速反蛛应AbAg高亲和力AbAg低亲和力特异日性结合景力的抓表示映方法亲和择力和粮亲合型力低亲合力高亲合力Ag哗-Ab反应副的原淋理Ab过剩Ag过剩比例适当，交联成网络Ag率-Ab反应节的可报见性常见乱血清萍学检羞测1.凝集猫反应直接凝集反应1:刑2稀释软待测芽血清1:朗4锹1滋:8井1勺:1傻6细菌到、细迷胞等茂颗粒雄性Ag或表少面包帽被抗瘦原的帜颗粒多状物费质与什相应Ab在电贩解质陈存在芦的情饼况下汇结合颤，出珠现肉邪眼可嚼见的盖凝集刚团现切象。玻片煌法试管挪法常用文于菌唐种鉴结定或AB厨O血型帽鉴定常用互于检昼测抗蛮体的胆滴度斑或效趣价，杆见于绳临床昏诊断街伤寒游或副柔伤寒次所用腊的肥晨达氏永反应洪和诊浆断布码氏菌泰病所肠用的钉瑞特妹试验产。间接烘凝集近反应将可党溶性Ag场/Ab先吸绢附在毅某些献颗粒卫载体哥上，曲形成奋致敏免颗粒姜，然建后再害与相炕应Ab/A黄g进行阻反应腿产生睁凝集院，叫粱间接纹凝集扑反应累。如圈将溶龟血毒甲素O吸附余于乳漠胶颗蓄粒上点的抗补“O”试验驰、人Ig论G作为Ag吸附样于乳肝胶颗窄粒上见的类颤风湿艳因子淹检测预。凝集旅反应匹常用姜于溶寸血性塔疾病伞的诊罩断：+YYYYYYYYYYYY病人送的RB辆C体内an烤ti贝-Rh由于涝抗体歼多属度于Ig布G，分麦子量乱较小繁，抗陷体与魂红细害胞间亩的结侧合力笋不能派克服遗细胞惩间的忠排斥惩力，革不出武现凝住集+YYYYYYYYYYYYYYY体外纪加入托抗人Ig验G出现毁凝集浸现象满，叫直接刃库姆诵试验正常概人O型血护的Rh+的RB逮C+YYYY患者陆血清叉内的警游离an乓ti疾-Rh+Y体外忍加入池抗人Ig次GYYYYYYYYYYYYYY出现国凝集径现象乳，叫间接底库姆盆试验2.沉淀患反应AgAgAgAgAbingel单向侮免疫可扩散Ag1AbAg2Ag3Ag4双向杂免疫凝扩散免疫身比浊过量AbAbAbAb毒素柏、组牺织浸刚液及张血清前中的祖蛋白苹等可史溶性毯抗原粘与相挺应抗镇体反摩应后烂，出查现肉终眼可碧见的畜沉淀狸物，画称为患沉淀致反应院。沉已淀反俭应可论在液洁体中多进行荐，也疯可在草半固兵体琼团脂凝典胶中闪进行幸。鉴定校多种荒抗原植是完装全相蜻同、喷部分罩相同志或完盯全不邻同用于神确定目抗原谋浓度沉淀房诚反应—免疫幕电泳存在腥于不眠同区透域的渠抗原类与抗榜体结幻玉合，祸在比屡例适苦宜处脸形成饰沉淀懒弧。扁沉淀青弧的摇数量绿、位坑置和贫形状猴与标俭准品雹相对岸比，谢可分歇析样偏品的恨成分耍及其荡性质傲。第二昆节算免疫俯组织录化学钻检测靠技术抗原您＋抗延体（饭特异瓣性）放＋酶岔标记串抗体呈，通滨过酶归与底愿物作并用生净成有秃色反梳应物州，定火位组阴织或煌细胞吹内抗录原的借一门丑技术换。免疫戚组织竹化学：用傅带标年记物倦的抗僚体或惰抗原爱在组辫织细戒胞原屋位通双过抗慈原抗屈体反级应或双组织住化学吐反应厕，对军相应骗抗或弯抗体傲进行泄定性历、定洁量、被定位益测定角的技疑术。免疫返组化捧分类免疫拦组织赢化学年技术衣按照暮标记椒物的顺种类汇可分盲为：免疫宋荧光羡法免疫芒酶法免疫运铁蛋其白法免疫舒金法放射泊免疫石自显堆影法按标掘记抗酿体的费方式许分：标记纱抗体IH贱CT法非标止记抗肆体IH的CT法非标纷记抗嫌体IH野CT法的浮二抗低不被妻标记谊，用该以免月疫动艳物制北备抗得酶抗瘦体，乔以酶-抗体据再与芒二抗攀结合严。按染壮色步促骤分奴：直接陵法（养一步卸法）间接贫法（2步法声或多符步法年）一、享检测炊原理通过差免疫俭学中体抗原有抗体吊结合看反应当，用腾特异班性抗累体(单克威隆或探多克果隆)或抗秀原检秩测组缸织、车细胞损内相秆应的务抗原河或抗久体物越质，照形成含抗原-抗体友复合幅物；全利用仁此复察合物他上带逗有预撞先标巾记的誉标记势物，旱通过杀与标幻玉记物灶相对刘应的各检测董系统挑，如早酶底痛物显贴色反怎应可钻使之酿呈现吨某种脆颜色榴，从挖而可那检测割组织撒细胞拿内的磁抗原港，以邻达到拥诊断椅、鉴必别诊伍断和债研究光的目绵的。可作缩慧为抗离原的蔬物质迁有酶、劈燕受厌体、御抗仍体、脉细本胞外积基质狠激素浙、溉细胞住结构例蛋白暮、病峡原体当。二、顾免疫遇标记羊物显补色原喂理免疫锹酶测唐定法免疫因荧光溉技术放射责免疫谨测定揭法免疫鸽胶体般金技牺术①免气疫酶钉测定氏法夹心司法EL挽IS掌A间接EL浇IS战ABA牺S—锤EL凶IS预A利用晃生物维素和兼抗生深物素赔蛋白目为桥稳梁微粒剃捕获胁酶免凤疫分丛析技叉术将已惰知特矮异性冤抗体肚致敏棵的免剖疫微窄粒与糠生物惹素、鸟亲和项素、曲酶相友结合纷，最尺后酶奥作用适于荧婶光底吩物发幼光，咐通过寄检测霜荧光障强度赔判断边未知教抗原抱的含职量。a）b）免疫灭组化诵技术定位细、定政性、者定量独检测②免躲疫荧哑光技狠术海马春细胞微管输蛋白粒绿色(胞体塔、树悼突)轴突澡终末振蛋白啊红色(突触)培养趋的成宽纤维刷细胞微管昂呈绿裙色撑核呈径蓝色③放摆射免初疫测删定用放穷射性拥核素伸标记容抗原土或抗参体进腥行的叼免疫呼测定然。将警同位思素的命敏感走性与拆抗原离抗体冒结合灶的特纠异性博结合膝起来镰，具岔有重丽复性查好、忘准确订性高忘等优奋点，居广泛放应用糕于激延素、锡药物幅等微性量物蚀质的巷检测已。常妄用的躺有13看1I、12绩5I。④化高学发葱光免醒疫技权术将化拿学发剧光分汽析和圈免疫逝反应根相结捎合而迫建立啊的一宇种新撒的免秃疫分惨析技隆术。池最常暑用的艘发光共物质累是鲁嫁米诺含。灵敏盐度高累、简柳便、擦可实赤现自象动化旬分析内。⑤免绞疫胶疏体金暴技术用胶挥体金蛛颗粒泳标记Ab/A迅g，以糊检测饰未知Ag匪/Ab的方兄法。氯金杠酸在脱还原挡剂作摧用下揉，可召聚合畏成特静定大肤小的池金颗叫粒，且形成眼带负窃电的嗽疏水骗胶溶懒液，雁因静将电作望用而炼呈稳史定的乳胶体锯状态宣。该技鼻术可西应用卡于免温疫组海化(光镜塔下检痛查)和免柳疫层唱析快凯速诊钻断。⑥免筛疫印牵迹法-W帮es饶te运rn勺b梦lo世tt激in屠g三、济标记雁抗体激的特拥点与典应用脊原理1、一痰级抗叙体（木第一绢抗体耻）希属识碎别系隐统，任特异疗性识露别来珍自样索本的择靶抗饥原。常用鞭单抗魂或多汪抗，五实验妄前-2较0滤℃—嫩-冤40翼℃保存越（1-潜2年有仗效）企，应精用液4℃约一毯周。援一抗歉的使窝用浓质度在回不同疑实验统中是旺不一则样的轧，最飘佳用伤量需拳经预少实验死确定蒸，一毅般选纠顶准兽阳性爬的稀脑释度辰。2、二乱级抗棚体（快第二促抗体床）沃连接醒放大算和酶物标显症色指成示系螺统的绍抗体蛮。属道桥连院抗体看，一钳手连泊一抗跨，一科手连臂标志畅物（际酶）秀，根据佛一抗练的物蹈种来县源选沫择相逃应的寒抗该销物种岔的二葛抗。如要泻在实膜验中阵同时填确定歇一抗堤、二梦抗的退浓度郑，最趟简单百的是雀方阵龙（棋含盘）侦滴定他法。3、非觉标志江抗体IH蚕CT和放车大检喂测系登统的芬应用雕原理1）酶-抗酶持法（PA妨P）利用点酶联洋抗体未将酶鸭与组台织切敲片中搭抗原吵相结译合，词通过惕与适脊当底寄物反谨应（爸通常瞎是H2O2）以朗及二表氨基鞭联苯杨胺(di混am芦in冶ob准en凝zi跃di铜neDA毕B)的显胖色剂右，产四生一捷种不优溶性阻棕色谷反应若产物张。该兄法已宜被进区一步松改进判发展姿为更窑敏感扫的多爱级桥抬联法量，后奶者利议于增医加在苹抗原指部位链反应将产物挨的沉曲积。PA换P法是挨酶-酶抗逢体(P挑AP因)复合陈物（着常用笼辣根醉过氧毁化物邻酶）议组成资的可殖溶性导复合江物为勒五环巾状结宽构，3个分冻子辣贩根过岩氧化丸物酶凡和二特个抗妄体分姑子组挂成，钟极为遇稳定轧，比睬免疫味荧光吸法敏倡感10墙0-条10耍00倍，棵比酶誉桥法贷敏感20倍，浙其原汽理是提特异愚性初套级抗夫体（挨一抗勾）的Fa牙b段与染组织恼抗原蜓结合传，二躺抗（予桥抗训）在膝一抗华与PA牺P复合喇物之钳间形医成分溉子桥亮联（违此时放一抗走与PA杆P中的副免疫箭球蛋护必须骨是同症一种世属，潜以使械得衍首生自看其它僚种属嫂的二题抗，凶对一痒抗分粘子PA展P中的FC段及茄稳定撒成份痰都具穗有特溉异性摘），狗洗涤卷后用H2O2和DA宪B显色肠，阳驶性为环褐红愉色，叼阴性茂无色勺。2）标访记的肆亲和滋素-生物贸素法历（LS察AB）生物软素是腿一种悬低分起子量悟的维生楚素，可黄以与棵抗体采（二于抗）钞共价裙结合蚊。亲迷合素烛是一俭种从发卵白医素中籍提取否的具判有4个生就物素真结合拥位点粉的糖星蛋白厕，借撑生物腔素与莲亲和肺素的麦结合谢，将偿抗体牙与酶券相连道，这佛一特具性能泥使之梨成为湾多级询免疫茎酶学店系统例各成匪分之推间的坑桥接内物。19扮81年Hs浩u等人遍建立读了抗体-生物慰素-亲和州素-过氧接化物殖酶(Av持id锤iNBi盟ot歪iN债-p贫er齐ox摸id四as肥eCo平mp道le垒x洪AB暖C)系统。该红方法黎是通蠢过生滤物素描相关瓦的次斑级抗歼体将远一抗把连接央到亲其和素-生物范素-过氧餐化物伸酶复惨合物作上。比PA单P法敏党感8-蓝40倍，塘特异我性强乏、非辜特异失性背虚景着盘色低愚、方遭法简狭便、纲应用啦广。AB俱C系统表通过价将链企球菌散抗生量物素绸蛋白慎代替东亲和黄素蛋雹白而古得到宽进一转步改辞进，援称为链球隔菌抗烛生物脱素蛋保白-生物受素系深统(St锡re毛pt蜘av倡id点iNbi岛ot柄iNsy妈st泉em某S芳AB希)。链球防菌抗倘生物勾素蛋刑白在蚊生理PH环境柜中为艺电中君性，伤而不沸产生证非特香异性久结合蝇，而确抗生扁物素捷蛋白花在生匙理PH环境距中带纳正电浪荷。明应用坚抗生伞物素克蛋白-生物局素法桐时，总内源喂性生魄物素娃能与性抗生杰物素伶蛋白-过氧刃化物杂酶复疲合物汤直接朗结合幻玉而产户生非浪特异凉性或姑称假胞阳性限染色罚，避少免的廉方法拼可先归通过需切片峡与游抬离抗牲生物柏素蛋村白反朝应以造去除触游离扑生物液素。葡萄叫球菌A蛋白(S回ta允ph蓝yl锡oc炕oc赠ca盗lpr伪ot价ei好NA格SP万A)是金世黄色铃葡萄习球菌质细胞坚壁上疤的一练种蛋裂白成更分，单链止多肽鲁，分阶子量粮为42梨00浆0，SP匙A最大郊的特德点是牛能与匆不同晋种属星血清巾中免娘疫球字蛋白栋分子芝稳定FC段结姥合，丸此外拣还能谊与其蕉它物艘质如融荧光恢素、已过氧仙化物杜酶、滥铁蛋莫白、严胶体腰金等爹结合岩，并说不影阻响其收生物适活性亩，因电此被椅用来俩发展祝为一粉种简痰便而阴迅速乔的免降疫过骄氧化曲物酶馅法，扇即用SP丛A代替PA互P技术述中的档次级丑抗体令，因SP桑A可与提多种解动物雕的抗悲血清阳反应寨，而珍不需斜因不乡丰同种多动物锤而制惭备相农应的拐第二纵抗体飘。SP役A可以选结合衡大多氧数Ig收G分子龟，可士以充率当第演一抗患体和漫衍生难自不感同种软属的喜抗过直氧化永物酶学抗体友的桥炮接物冶即SP陡A-过氧京化物否酶联犬法。市同时祥由于SP奴A与FC段的除高亲旱和力表可以忠减少捏非特元异性葬背景削染色杯。3）多移聚螯藏合物宣法将抗该体和HR冷P共同穗连接触在葡银聚糖贱聚合搭物上蠢，形抖成抗透体—多聚五化合野物—酶。每灵敏赔度高调，每叹个聚碑合物涉有超逃过20个点项与一樱抗结踪蝶合。4、现莲色系杨统主要邻有DA淋B，AE妨C（3-氨基-9径-乙基诉卡巴灭唑(A批EC岗)）均索以HR文P为供留氢体余。固红仁，固劣蓝，予氯蓝弃四唑扛（NB谋T），渠以碱暮性磷妥酸酶哄为现碧色剂济。四、富基本旁操作她过程全过义程为粉：抗梁原制筐备与血纯化非；抗烈体制商备；私标记于抗体邮制备咽；标固本采哥集与洒制备题；免壳疫组荡化反魂应与粱现色删；结扔果观拜察与昆分析急。1、标壳本采冰集与毅制备石蜡劈燕切片宰细崭胞爬降片冰冻直切片体细绩胞涂而片组织茂印片石蜡催切片芒过程置：取张材—固定—冲洗—脱水—透明—浸蜡—包埋—切片—贴片—烤片—脱蜡—复水—染色—脱水—透明—封藏群等步盲骤。组织迷标本组织映标本冰冻织切片州操作历方法姜及技亚术要我点：①取科材，此未能注固定第的组云织取连材，颗不能弊太大罗太厚怖，厚冬者冰宽冻费眨时，苹大者潜难以拼切完即整，见最好容为24船×2击4×次2m艺m。②取电出组刃织支泉承器饱，放蜡平摆馋好组适织，豪周边兼滴上四包埋捧剂，府速放捎于冷枣冻台倡上，懒冰冻内。小森组织月的应密先取竿一支家承器存，滴什上包乳埋剂好让其笔冷冻催，形生成一母个小斜台后吩，再闸放上否细小壁组织价，滴差上包誓埋剂搜。③将凡冷冻邮好的绞组织系块，幻玉夹紧慎于切月片机脸持承季器上涝，启交动粗劝进退傍键，伙转动滴旋钮妙，将慨组织都修平粒。④调双好欲霜切的烤厚度渗，根蚂据不怨同的房诚组织连而定炕，原财则上令是细包胞密狐集的寺薄切呜，纤临维多昌细胞勤稀的溪可稍绿为厚耻切，庆一般肆在5～10馆um间。要注也意的锄是：①组绣织快显大小名合适②选膛择合蜜适的痒冷冻于度答未固完定过母的组苗织-1模0—测-1帖5℃，脾、劣肾、浴肌肉嗓等-1虫5—哀-2谈0℃，含柿脂肪序组织-2锯5—川-3奸0℃。③及爬时清磁除残思余的苏包埋现剂，孙防止晓撕裂侄组织抱。④组秆织块伶无须辞固定⑤用扎于附壤贴切俗片的绍载玻帝片室庆温存摆放，拴无须献冷冻胜。⑥切到片不皇能马偶上染匙色的挖可晾解干低宽温冷悄藏，滥或置洽组织黑培养饶液内傲。0-椅4绳℃保存唉。2、免曾疫化感学染锡色酶法也染色免疫风荧光旅染色追标稍本处滑理—荧光殿试剂—封片宗观察一般劝为冰眉冻切撤片，倚石蜡铁切片著效果盛差。免疫魂胶体考金染话色免疫菌金银伏染色免疫环双重/多重塘标记院染色岛同一爱切片情的同障一组帝织上渗同时纺显示2种/以上短的抗口原成搬分，灰也称永免疫端组化胖双染教法。征要求2种抗贴原分页布于厚细胞箱不同净部位瓣。针匀对抗葱原使互用不饺同颜恳色的析荧光拦素、偿酶或傻不同裙直径恢的颗虏粒。五、撒免疫对组化律的影殊响因柄素与胶对策1、非接特异师性着挤色由内市源性易酶和旗生物芹素干怒扰余灭活营酶，厚用亲没和素贺饱和到生物危素。电荷兵吸附BS蹦A或二染抗动兴物血待清封津闭非棵特异丧位点奴。抗体锦原因抗体畏不纯振或标舌本含聋与靶界抗原出类似唱的表墙位。巡寿用单骨抗。洗涤赚不充眼分加去联污剂弟等洗恨。DA守B不溶能性颗代粒未打除掉序而沉葱积在卫组织瓶上。制片她不当赖坏死外、变铺性、锈炎症孕组织贩、切睁片拱锤起、塘皱缩血、边铅沿缺带损等想。二叮抗动体物血著清封纷闭或谁重切帅。2、组创化染待色的卫假阴盗性标本虽保存哑不当晨老旧划标本跟、固脂定不便当或亩固定或时间鹊太长稀、温潜度过煎高等细，改乡丰善条公件，畜重做远。抗体鸟等试津剂质昨量差母滴度倍、纯码度、榆特异症性或妥保存翁不当瓦，更同换新将试剂谷再做烛。操作侧失误盾严格遥按操夜作规爷程作中。3、杂凡音免疫撇组化膊中的茂非正患常的平背景更着色卵。常见云于抗积体浓演度过帅高、掀切片舰粘贴书不牢洪，边姥沿松肌动等第三休节配免疫栋印迹损技术19搅79年Re醒na唉rtan新dTo旷wb呼in将So芝ut尖he拍rn旅b扣lo朋tt紫in心g技术表应用趴与蛋券白质申研究冰，并娃与酶贵免疫挽技术役结合虹建立鸭的蛋镰白检编测技泛术。灵敏耕度高翠，1-碎5ng。简辅单、镇快速民、经简济。目前拼，广厨泛用疏于蛋柏白质责相互到作用恭研究胀和抗孕原性菌研究顺。一、今原理加：蛋白光质组隔分经SD竭S-卫PA狱GE分离暮后，荒平行往转移仇到固篮相支岁持体劝（NC膜或PV逝DF膜）竖上，胜通过疲免疫旱试剂涛来检污测靶戚蛋白熔。浸泡塔式电等转移源的条对件温编和，绸对蛋拴白样傲本损僚失较魂小，缺点餐是耗含时长隶，需艰大量辛缓冲键液；例半干践式电番转移解时间短，尊但有辆可能烈损伤盛样品膨。今瞒天采桥取浸艺泡式纷电转蚁移。靶蛋衡白的康检测凳通常闷采用笔两步翼法或讽间接猪法，榆用一糖抗结合靶油蛋白院，再滨用过叨氧化御物酶茄（HR蔑P）标记赔的二盗抗结合率一抗舒，然糊后HR声P催化秤化学鸟显色耗反应注或化惕学发光反肿应。调当前悲多采历取化忠学显油色反搅应。免疫户学检起测封闭加一计抗网洗膜加二限抗洗膜加底印物试验耀记录摇育抚过夜摇育解2h（3旋次，掉每次子10mi遇n婶）摇育没1h二、亭操作陶过程1.斥S励DS糊-P香AG池E电泳2.电转彼移：将冷脉却管怕接上灯水龙锐头，贩接上拒电源汤，根旨据凝宿胶面免积调抗节电命流（0.弦65丑mA蚊/c筒m2），时间2小时蹄。3.电转敞移结舞束后池，打严开夹的板，榆剪下NC膜左址右上杀角做洋标记诱（即券标记本有蛋涝白结胸合面竖）。滔然后农把NC膜分厌为两帐份，铲其中叉一份萄放入童氨基砍黑染搁色液卸中染是色30～60秒，10％乙滑酸漂燥洗，门观察滴膜上嗓有无颜蛋白芳条带径。如果挠有，莫可用凝另一谊份继索续以贪下的川实验碍。4.封闭季：（将NC膜上拜无蛋锄白结坊合处肾封闭哥，防拿止探营针的晌非特凯异性业结合忆）在竞一培被养皿涝内倒拨入封冷闭液春（5％脱般脂奶克粉）作，将嘱未染铲色的NC膜放槽入浸刚泡，用室温区放置1小时洒。5.探针压结合昨：封夺闭结村束后宇，用PB脉S漂洗娇一次狠。倒疲干PB脊S后，屡加入HR辜P标记狸羊抗稿鼠Ig骄G稀释渡液，37ºC孵育1小时捏。6.孵育移完成垂后，PB堵S漂洗介三次扫（每来次浸朴泡3分钟蜻），侵将未肿结合营探针烫尽可雨能洗赏掉。延倒干PB克S后，圆加入贞底物然工作任液，货避光爪显色10分钟蔬，观读察颜阻色变医化。三、肢影响膝因素岔与对红策1、影卖响SD茫S-导PA便GE的因接素2、影息响蛋旨白转抵移的茧因素幕转移仗膜的姨活化行与大绿小、语缓冲邪液、别是否樱平整有、有包无气应泡、熄电压抛、温爷度、弃转移屿时间钱等。3、封躁闭穷封墓闭试排剂浓锻度不枯能过狐高过冒低。4、显驳色译设棍立阴限阳性赌对照裂，DA稍B显色仁后立四即照扒相，喊否则朗易腿候色。酶免义疫技烛术按旧目的分类（一协）酶养免疫劣组织返化学阔测定久技术（二拔）酶畅免疫棚测定到技术Ab*＋Ag畅→Ab*A洋g＋Ab*Ab＋Ag相*状→Ab族Ag*＋Ag若*（1）Ho肃mo敲ge畜no昼us（均杀相测谈定）（2）He国te币ro舌ge氏no亭us（异涂相测铲定）——旬S想ol堆id要p耳ha锤se——谢li麻qu满id恭p脚ha秩se第四会节酸酶联拌免疫复检测血技术一、EL毫IS捎A的基取本原绘理EL疤IS药A(臂En森zy和me-L身in呈ke得dim姨mu揭no天so虹rb很en旧tas柳sa果y)的基摄础是免抗原岂或抗果体的授固相纠化及昼抗原蕉或抗比体的厌酶标鸭记。灶这一付方法孩的基屋本原银理如往下。（1）使兽抗原真或抗绩体结狼合到淡某种壁固相侄载体柴表面洋，并源保持蓝其免煌疫活躁性；（2）使续抗原留或抗基体与政某种昨酶连拒接成危酶标恼抗原落或抗威体，傻这种就酶标秩抗原浴或抗嘴体既扩保留组其免蛾疫活许性．叙又保萄留酶造的活垫性。二、则基本守操作索流程测定橡抗原僚常用席双抗引体夹冶心法未，测头定抗尚体用狂间接哭法。基本截过程为：固相马包被验（吸卵附已如知成播分、疼洗涤吓、封锣闭、侦洗涤锣）加待飞测样纠品妥促反稳应内洗滥涤侨加酶肾结合狼物促反蓄应废洗届涤狭加瓣酶底姓物宫促反国应替终兰止反逗应测定思（比伟色、跃荧光饶）EL幅IS夺A的类善型：EL铺IS舰A可用斧于测料定抗讯原，识也可毒用于兼测定换抗体肯。用预于这撤些目舍的的粥检测线方法宇主要森有以叛下几搬种类夏型。1双抗尖体(原)夹心两法2间接筑法3竞争岂法4双位扭点一断步法5捕获枣法测Ig激M抗体6应用杠亲和虑素和勉生物煎素的EL傻IS世AEL惹IS奶A的类利型EL攀IS然A可用苗于测弊定抗旷原，选也可狱用于巨测定授抗体来。在位这种死测定等方法拘中有炼三个辞必要铜的试枪剂：（1）固拉相的惊抗原略或抗据体，毯即"免疫石吸附灰剂"（im紧mu刻no世so茎rb贩en覆t）；（2）酶标付记的恶抗原吨或抗瘦体，沫称为"结合循物"（co体nj壳ug依at腊e）；（3）酶反叮应的遣底物唤。可设贞计出辞各种榴不同悠类型匪的检衡测方圾法。1、夹筒心法过程旁：包伐被勉加待废测样虏品乔洗之涤骑加酶插标记饥物批洗涤加底美物虽测定1）双敲抗体柄夹心觉法测穗抗原此法挤适用异于检浓验各拴种蛋困白质手等大块分子债抗原闹（二洋价及吨以上押），羊例如HB售sA差g、HB屋eA骆g、AF怨P等。晴只要宇获得堆针对耀受检佳抗原厘的异蓄性抗蛮体，仇就可嘴用于博包被歉固相匠载体裙和制负备酶借结合渗物而切建立俭此法拴。2）双贩抗原昂夹心滴法测皇抗体用特姓异性变抗原趴进行贪包被兽和制腹备酶架结合湖物。恭此法挣中受钢检标浆本不轿需稀拾释，废可直奏接用胞于测篮定，抄因此岗其敏牲感度轿相对个高于崭间接涛法。茂乙肝特标志对物中宣抗HB占sA耍g的检测该常采邪用本夹法。论本法脚关键屈在于冰酶标单抗原迫的制付备，因应根捏据抗头原结荷构的聋不同肤，寻内找合乖适的野标记络方法咬。2、间滥接法堡测抗忌体1）间融接测河抗体地法传染杯病的懒诊断惑。间悟接法付的优县点是外只要还变换阳包被赤抗原球就可受利用累同一脏酶标淹抗抗兵体建摧立检神测相仙应抗征体的弹方法悄。2）间侍接测酷抗原雾法3、双傅位点物一步代法测定近抗原由双沾抗体杠夹心碗改进唱而来拉，将逃双抗凳体夹顺心中吧针对寸同一羡抗原貌决定昨簇的2种抗誓体改昆为针柳对抗豆原不看同决茅定簇疑的2种单辈抗。评敏感灶性和费特异棒性大趟为提滥高。但抗软原过陈量，Ag分别命与固争相抗钟体和肝酶标雾抗体虾结合款，抑昂制夹比心复倦合物色形成材，出章现所控谓钩蜜状效讨应，惰甚至制假阴设性结性果。过程手：Ab柿1包被苗加待键测样偶品和尊酶标Ab器2洗涤披底愚物也可籍用双寨抗原络夹心蔽测抗迈体4、竞弯争法贡测抗挎体过程忍：将集待测支抗体厌（原居）同投时加谢入包燃被孔爷，洗稻涤除校去酶渔标记直物，贱加底瞧物测郑定。用于丝式测定且只有怪一个惜决定意簇的秘小分垦子抗得原或池半抗扇原，作当抗祥原材岸料中麦的干藏扰物雀质不妄易除沈去，防或不乎易得知到足售够的模纯化韵抗原穗时，史可用锤此法柜检测杠特异墙性抗慨体。竞争牺法测料抗原小分茅子抗页原或路半抗贩原缺皂乏可跌作夹绪心法锈的两起个以岗上的位点，因趟此不筝能用宾双抗傅体夹惯心法戒进行崖测定刚，可转以采疏用竞捕争法闲模式钩。其炮原理患是标渗本中地的抗金原和配一定址量的摸酶标逃抗原淡竞争呜与固谜相抗胳体结立合。棚标本拆中抗撑原量朽含量辩愈多我，结中合在妙固相召上的婚酶标两抗原省愈少吵，最疮后的傍显色吧也愈溪浅。位小分曲子激赤素、待药物斧等EL椒IS妨A测定孟多用带此法距。竞争EL坦IS倡A检测焦抗蜻原5、