亲合组织化学技术

亲合组织化学技术第一页，共二十七页，编辑于2023年，星期五发展历史60年代：发现生物素和卵白素70年代：植物凝集素、生物素、葡萄球菌A蛋白------BRAB、LAB、SPA-HRP、ABC…亲和组织化学：1976年Bayer首次提出包括植物凝集素和糖类、生物素和抗生物素、葡萄球菌A蛋白与IgG、阳离子与阴离子、激素、维生素、糖及类脂质作用部位和受体等第二页，共二十七页，编辑于2023年，星期五植物凝集素(Lectin)生物素(Biotin)葡萄球菌A蛋白(SPA)SPA—HRP法、ABC法和LAB法等。亲合组织化学技术定义：是以一种物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础，建立的组织细胞基础化学技术。本质：区别于一般的组织化学，非抗原抗体反应。优点：敏感性高，有利于微量抗原（或抗体）在细胞或亚细胞水平的定位。第三页，共二十七页，编辑于2023年，星期五一抗生物素—生物素免疫细胞化学技术

二葡萄球菌蛋白A技术

三凝集素组织化学技术四其它亲和细胞化学第四页，共二十七页，编辑于2023年，星期五一、抗生物素—生物素免疫细胞化学技术

(一)基本原理

亲合素（抗生物素/卵白素）是鸡蛋白中含有的一种碱性蛋白，属于糖蛋白;具有4个同维生素H(生物素)亲合力极高的结合点。

链酶亲合素

是一种从链酶菌培养物中提取的蛋白质，和亲合素一样，也有四个生物素结合位点，是一种亲和力更高的生物素结合蛋白。生物素（维生素H）是一种小分子的水溶性维生素，它与亲合素／链酶亲合素之间有很强的亲合力，较之抗体对抗原的亲合力要高出100万倍，能够彼此牢固结合而不影响彼此的生物学活性。★

生物素、亲合素、链酶亲合素：能与荧光素、铁蛋白和过氧化酶等相结合。★

亲合素、链酶亲合素：同一定浓度的生物素化酶混合后，形成亲合素一生物素一酶复合物。这种复合物可以和各种生物素标记抗体结合。第五页，共二十七页，编辑于2023年，星期五（二）几种亲合素—生物素染色技术

1亲合素一生物素—过氧化物酶复合物技术(ABC)2．链酶亲合素-生物素-过氧化物酶复合物技术(SABC法)3．标记生物素—抗生物素技术(LAB)4.SP/SAP法5.Envision法6.CSA法第六页，共二十七页，编辑于2023年，星期五ABC复合物：亲和素－生物素－过氧化物酶复合物1亲合素一生物素—过氧化物酶复合物技术(ABC)第七页，共二十七页，编辑于2023年，星期五⑴基本原理

是将亲合素作为“桥”与生物素化的抗体与生物素结合的酶（HRP)连接起来。

第一抗体：为未标记特异性抗体，能结合组织中待测抗原；第二抗体：为生物素化的桥抗体，能与第一抗体结合；

第三抗体：是结合了过氧化物酶的亲合素复合物(即ABC)。优点：敏感性强（比PAP高20-40倍）；特异性强，背景染色淡；方法简便，节约时间（比PAP缩短2h）

；由于生物素与抗生物素具有和多种示踪物结合的能力，可用于双重或多重免疫染色。第八页，共二十七页，编辑于2023年，星期五⑵操作步骤①冰冻切片或石蜡切片均可。②冰冻切片：丙酮固定，PBS洗5min，更换3次。石蜡切片：脱蜡，系列酒精至水。③第一抗体孵育，过夜。④PBS洗5min，更换3次。⑤加生物素标记的第二抗体，孵育15min。

⑥PBS洗5min，更换3次。⑦加ABC复合物室温作用15min。⑧PBS洗5min，更换3次。⑨用DAB显色。⑩复染、封片、观察。⑶结果

呈棕黄色为阳性表达，核被苏木精染成浅蓝色。第九页，共二十七页，编辑于2023年，星期五(4)注意事项

①消除内源性生物素：染色前以0.01％的亲合素和0.01％生物素溶液分别作用20min以消除内源性生物素活性，每次作用后用PBS漂洗3次，5min。②消除内源性过氧化物酶：可用3％H2O2孵育5-10分钟以灭活内源性过氧化物酶活性。蒸馏水洗3次。③试剂的保存：温度以4℃为佳，可达2年之久，在－20℃时其生物活性反而在短期内被破坏。

此外，生物素制剂之间相互亲和性差异大，注意厂家和批号。第十页，共二十七页，编辑于2023年，星期五SABC法原理：一抗＋生物素化二抗＋SABC复合物SABC复合物链霉卵白素－生物素－过氧化物酶生物素标记的二抗链霉卵白素连接生物素标记的酶。优点：敏感性略高于SP法，低背景和操作简便缺点：因体内含有内源性生物素，易产生非特异性染色。

一抗+生物素标记二抗+滴加试剂SABC（链霉卵白素+辣根酶标记生物素)+辣根酶底物显色

2链酶亲合素-生物素-过氧化物酶复合物技术(SABC法)第十一页，共二十七页，编辑于2023年，星期五SABC试剂盒(含正常血清，生物素化二抗，SABC等)操作程序1）载玻片防脱处理：可选择APES或Poly—Lysine，烤片。2）切片常规脱蜡至水。3）3％H202灭活内源性酶。蒸馏水洗3次。4）抗原热修复：将切片浸入枸橼酸盐缓冲液(PH6.0)，电炉或微波炉加热至沸腾后断电，间隔5—10分钟后，反复1—2次。冷却后PBS洗涤。5）滴加5％BSA封闭液，室温20分钟。甩去多余液体，不洗。6）滴加适当稀释的一抗，37℃1小时左右或20℃2小时左右。也可4℃过夜。PBS(pH7.2—7.6)洗2分钟×3次。对照切片用PBS代替一抗。第十二页，共二十七页，编辑于2023年，星期五7）滴加生物素化二抗，20—37℃20分钟。PBS(pH7.2—7.6)洗2分钟×3次。8）滴加试剂SABC，20—37℃20分钟。PBS(pH7.2—7.6)洗5分钟×4次。9）DAB显色：使用DAB显色试剂盒。取1ml蒸馏水，加试剂盒中A、B、C试剂各1滴，混匀后加至切片。室温显色，镜下控制反应时间，一般在5一30分钟之间。蒸馏水洗涤。10）苏木素轻度复染。脱水，透明，封片。显微镜观察。结果

棕褐色为阳性结果，而细胞核染为淡蓝色。第十三页，共二十七页，编辑于2023年，星期五

注意事项

1）染色背景过高：

在SABC反应之后，DAB显色之前，用加有0.0l一0.02％TWEEN20的PBS(pH7.2—7.6)洗涤切片4次，单纯PBS洗2次，然后DAB显色。

2）抗原热修复：可选0.01M枸橼酸盐缓冲液；也可以使用PBS、TBS等多种缓冲液。第十四页，共二十七页，编辑于2023年，星期五3标记生物素—抗生物素技术(LAB)原理：

第—抗体：生物素标记；

第二抗体：酶标记抗生物素(亲合素)操作步骤：

⑴切片中加入生物素标记一抗，室温孵育1h，。⑵0.01MPBS洗3次，每次5min。⑶20-50ug／mlHRP-抗生物素液孵育。0.01MPBS漂洗3次。⑷DAB显色。蒸馏水漂洗。⑸苏木精复染核。梯度乙醇脱水、透明、封片、镜检。

应用不如ABC普遍，但手续较简便，但灵敏度低。第十五页，共二十七页，编辑于2023年，星期五SP法（过氧化物酶标记的链霉卵白素/过氧化物酶标记的碱性磷酸酶染色）

原理：一抗＋生物素化二抗＋酶标记的链霉卵白素优点：高灵敏度、低背景、操作方便缺点：不适用于内源性生物素丰富的组织

第十六页，共二十七页，编辑于2023年，星期五三步法（以SP试剂盒为例）

•

石蜡切片脱蜡至水。

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蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，如需采用抗原修复，可在此步后进行。

•3%H2O2室温孵育5-10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性，PBS冲洗，2分钟×3次。

•5-10%正常山羊血清封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1-2小时或4℃过夜。

•PBS冲洗，2分钟×3次。

•

滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），37℃孵育10-30分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10-20分钟。

•PBS冲洗，2分钟×3次。

•

滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释），37℃孵育10-30分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10-20分钟。

•PBS冲洗，2分钟×3次。

•

显色剂显色（DAB或AEC）。

•

自来水充分冲洗，复染，脱水透明（如需要）、封片。第十七页，共二十七页，编辑于2023年，星期五原理：将二抗和酶通过一个多聚葡聚糖骨架联接成一个多聚体

优点：1简便、快速、敏感性是SP、SABC法的几十倍。2人体组织中不含有这种多聚物，从而避免了组织中生物素的干扰缺点：因大分子穿透核膜困难,对于核内抗原的定位不能选用此法。Envision法一抗+二抗标记多聚螯合物酶Envision法第十八页，共二十七页，编辑于2023年，星期五EnVision工作程序：

1）脱蜡、水化组织切片。

2）预处理组织切片（据一抗具体说明而定）

3）蒸馏水漂洗，置于PBS中。

4）阻断内源性过氧化物酶（仅用于EnVisionTM/HRP）

5）蒸馏水漂洗，置于PBS，10分钟

6）一抗孵育10-30分钟

7）PBS漂洗10分钟

8）EnVisionTM孵育10-30分钟

9）PBS漂洗10分钟

10)色源底物溶液孵育10分钟

11)蒸馏水漂洗

12)复染及封片第十九页，共二十七页，编辑于2023年，星期五CSA法（催化信号放大法）原理：是酪胺的过氧化物酶反应(即HRP催化酪胺盐，形成共价键结合位点)，产生大量的酶促产物，该产物能与周围的蛋白残基(包括色氨酸、组氨酸和酪氨酸残基)结合，这样在抗原—抗体结合部位就有大量的生物素沉积，与随后加入的链霉亲和素—HRP结合，如经几次这样的循环放大，可以网络许许多多的酶分子，最后通过DAB的显色反应，其敏感性得到几何级放大。优点：比EnVision法敏感20～100倍。适合于实验病理学和第一抗体昂贵、抗原性较弱的IHC检测以及抗原破坏严重、抗原量较少的组织细胞抗原的检测方法;核内抗原的检测（原为杂交）。缺点：操作步骤多、孵育时间长，存在严重的内源性干扰，背景染色有时较重。第二十页，共二十七页，编辑于2023年，星期五二、葡萄球菌蛋白A技术

葡萄球菌蛋白A(SPA)：

金黄色葡萄球菌细胞壁分离的蛋白质，作为桥抗体或标记抗体不受种属特异性的限制，它能和人及许多动物IgG结合，对IgG免疫球蛋白亚型的结合有选择性。

葡萄球菌蛋白A(SPA)技术原理：结合部位是Fc段，不影响抗体的活性；结合力是双价的，可同时结合两个IgG分子；可将酶、荧光素、胶体金等标记在SPA上。第二十一页，共二十七页，编辑于2023年，星期五SPA应用:

1免疫球蛋白的制备和分析

能和IgG及其某些Fc段结合，可提纯、分析免疫球蛋白制剂。

2应用于免疫细胞化学

结合力是双价的，可作为桥抗体或标记抗体。且不受种属特异性限制；

分子量小，穿透力强。

3应用于多种细菌、支原体和病毒的简易快速诊断

SPA菌体为载体，结合特异性抗体成为一种吸附原，作协同凝集素，用于细菌、病毒的定群和分型。

4可作为固相吸附剂研究免疫复合物、膜抗原、膜受体和膜Ig

第二十二页，共二十七页，编辑于2023年，星期五SPA在免疫细胞化学染色中的应用SPA可被荧光素、酶、胶体金、铁蛋白等标记，其中最常用的酶为HRP1SPA-HRP用于间接法的染色

(1)切片脱蜡至水，3％H2O2抑制内源性过氧化物酶活性。

(2)水洗后，PBS漂洗。

(3)加一抗，37℃孵育60min或4℃过夜。0.01MPBS漂洗3次。

(4)SPA-HRP室温30min。0.01MPBS漂洗3次。

(5)DAB显色。

(6)苏木精复染，脱水，透明，封固。第二十三页，共二十七页，编辑于2023年，星期五2SPA用于PAP法的染色

(1)切片脱蜡至水，0.3％H202甲醇处理切片。

(2)10％卵蛋白Tris缓冲液处理20min。

(3)加第一抗体37℃孵育60min或4℃过夜。

(4)0.05MTris-HCl，pH7.6，洗涤3次。

(5)SPA(1ug／m1)孵育15min，0.05MTris-HCl溶液漂洗3次。

(6)PAP复合物(无动物种属限制)孵育15min。0.05MTris-HCl溶液漂洗3次。（抗酶抗体+足量的酶==形成稳定的五角形复合物）

(7)DAB显色。

(8)苏木精复染，脱水，透明，封固。第二十四页，共二十七页，编辑于2023年，星期五三、凝集素组织化学技术凝集素(1ectin)：从各种植物、无脊椎动物和高等动物中提纯的糖蛋白或结合糖的蛋白，能凝集红细胞。常用：刀豆素(ConA)、麦胚素(WGA)、花生凝集素(PNA)、