专题和蛋白质技术

专题和蛋白质技术第一页，共七十三页，编辑于2023年，星期五课题1DNA的粗提取与鉴定

第二页，共七十三页，编辑于2023年，星期五一、提取DNA的方法1、提取生物大分子的基本思路（1）选用一定的________或________方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。（2）

DNA的粗提取就是利用DNA与______、______和________等在物理或化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。物理化学RNA蛋白质脂质第三页，共七十三页，编辑于2023年，星期五（1）利用DNA的溶解性 DNA的溶解度2、提取DNA分子的基本原理第四页，共七十三页，编辑于2023年，星期五

DNA不_______酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则_______酒精。利用这一原理，可将DNA与蛋白质进一步分离。溶于溶于第五页，共七十三页，编辑于2023年，星期五①蛋白酶能水解蛋白质，但对________没有影响。②大多数蛋白质不能忍受____________的高温，而

DNA在80℃以上才会变性。③洗涤剂能够瓦解__________，但对________没有影响。温度洗涤剂DNA60-80℃细胞膜DNA（2）利用DNA和蛋白质对酶、_______和________的耐受性不同第六页，共七十三页，编辑于2023年，星期五（3）DNA的鉴定：

DNA在沸水浴的条件下，遇________反应会呈现________二苯胺蓝色第七页，共七十三页，编辑于2023年，星期五二、DNA的粗提取与鉴定的实验设计（一）实验材料的选取

材料：新鲜的鸡血注意：本实验中，要往鸡血中加入抗凝剂（柠檬酸钠溶液）

原则上只要含DNA的生物材料都可以，但是选取DNA含量相对较高的生物组织，成功率更大。第八页，共七十三页，编辑于2023年，星期五(1)先将新鲜的鸡血离心，获得鸡血细胞(2)在鸡血细胞中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液1、破碎细胞讨论：为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？利用了什么原理？2、过滤，获取含DNA的滤液第九页，共七十三页，编辑于2023年，星期五（三）去除滤液中的杂质讨论：为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质

答：用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质第十页，共七十三页，编辑于2023年，星期五讨论：方案二与方案三的原理有什么不同？方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的DNA与蛋白质分开；方案三利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA分离

方案二利用了酶的专一性；方案三利用了DNA的稳定性。第十一页，共七十三页，编辑于2023年，星期五（四）

DNA的析出与鉴定DNA的析出用的是与滤液体积相等的冷却的酒精溶液（体积分数为95％），静置2-3min，溶液中会出现白色丝状物，这就是粗提取DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水1、DNA的析出第十二页，共七十三页，编辑于2023年，星期五A:2mol/L的NaCl溶液5ml+DNA丝状物+

二苯胺试剂4ml

B:2mol/L的NaCl溶液5ml

+二苯胺试剂4ml混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min,待试管冷却后，比较两只试管中溶液颜色的变化，看看溶解有DNA的溶液是否有蓝色2、DNA的鉴定第十三页，共七十三页，编辑于2023年，星期五以鸡血为实验材料进行DNA的粗提取②鸡血细胞极易吸水胀破，而用动物肝脏细胞作实验材料常常需要匀浆和离心，对设备要求较高，操作繁琐，历时较长1、鸡血细胞做实验材料的原因①鸡血细胞核的DNA含量丰富，材料易得第十四页，共七十三页，编辑于2023年，星期五2、实验原理①DNA在NaCl溶液中的溶解度，是随着NaCl的浓度的变化而改变的。当NaCl的物质的量浓度为0.14mol／L时,DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使溶解在NaCl溶液中的DNA析出。②DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质可以溶于酒精溶液。利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的DNA。③DNA遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。第十五页，共七十三页，编辑于2023年，星期五实验材料和用具实验材料：1、鸡血细胞液（5~10ml）；2、体积分数为95%的冷酒精溶液（实验前置于冰箱内冷却24h）；3、蒸馏水；4、质量浓度为0.1g/ml的柠檬酸钠溶液（抗凝剂）5、物质的量浓度分别为2mol/L和0．015mol/L的NaCl溶液；6、二苯胺试剂第十六页，共七十三页，编辑于2023年，星期五第十七页，共七十三页，编辑于2023年，星期五答：因为DNA不溶于冷酒精，而其他物质可以溶解在酒精中，使含杂质较少的DNA丝状物可以析出,悬浮于溶液中讨论：（2）观察丝状物呈什么颜色？答：白色（1）为什么要加50mL的冷酒精？第十八页，共七十三页，编辑于2023年，星期五答：有丝状物的试管变成蓝色，另一试管还是原来颜色（4）这一鉴定结果说明什么问题？（3）比较两个试管中溶液的颜色有什么不同？答：提取出的丝状物是DNA（5）DNA的直径约为20×10-10m，实验中出现的丝状物的粗细是否表示1个DNA分子直径的大小？答：DNA分子直径只有2nm。丝状物是多个DNA子聚在一起形成的第十九页，共七十三页，编辑于2023年，星期五答：整个实验共“两次蒸馏水，三次过滤，六次搅拌”总结：①两次蒸馏水第一次：使鸡血细胞吸水胀破，提取核DNA

第二次：稀释NaCl溶液，使DNA黏稠物析出（1）此实验过程中有几次使用蒸馏水？几次过滤，几次搅拌？第二十页，共七十三页，编辑于2023年，星期五②三次过滤第一次：过滤核外物质，除去不溶的杂质第二次：过滤除DNA的其他核内物质，尤其是蛋白质

第三次：过滤含DNA的NaCl溶液，得到滤液

第二十一页，共七十三页，编辑于2023年，星期五六次搅拌：搅拌目的第一次

搅拌加蒸馏水的鸡血细胞液，加速细胞破裂第二次

搅拌含DNA的高浓度盐溶液，加速

_______________________第三次

搅拌加蒸馏水的NaCl溶液，

____________________________第四次

搅拌含DNA的高浓度盐溶液，加速

_______________________第五次

搅拌含DNA的酒精溶液，提取

__________________________第六次

搅拌含DNA白色丝状物的盐溶液，加速

__________________DNA的溶解均匀稀释以析出更多DNADNA的溶解含杂质较少的DNADNA的溶解第二十二页，共七十三页，编辑于2023年，星期五

观察你提取的DNA颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多；二苯胺鉴定出现蓝色说明实验基本成功，如果不呈现蓝色，可能所提取的DNA含量低，或是实验操作中出现错误，需要重新制备四、课题成果评价（一）是否提取出了DNA第二十三页，共七十三页，编辑于2023年，星期五

本实验提取的DNA粗制品有可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质（二）分析DNA中的杂质第二十四页，共七十三页，编辑于2023年，星期五课题2多聚酶链式反应扩增DNA片断第二十五页，共七十三页，编辑于2023年，星期五DNA分子的结构C、H、O、N、P1.元素组成：脱氧核苷酸2.基本单位:第二十六页，共七十三页，编辑于2023年，星期五3.DNA分子的双螺旋结构（1）DNA分子是由

的（脱氧核苷酸长链盘旋而成的规则

结构。（2）

与

交替连结，排列在外侧，构成基本骨架；

排列在链的内侧。（3）两条链上的碱基通过

连结起来，形成碱基对。碱基对的组成有特定的规律：即腺嘌呤一定与

配对，

一定同胞嘧啶配对。双螺旋两条反向平行脱氧核糖磷酸碱基氢键胸腺嘧啶鸟嘌呤第二十七页，共七十三页，编辑于2023年，星期五4.DNA的复制b.时期有丝分裂间期减数第一次分裂前的间期。c.场所细胞核（主要）、线粒体、叶绿体。a.概念由一个DNA形成两个完全相同的DNA的过程。d.基本条件酶:解旋酶、DNA聚合酶能量:ATP原料:四种脱氧核苷酸模板:DNA的两条链第二十八页，共七十三页，编辑于2023年，星期五参与的组分在DNA复制中的作用解旋酶DNA母链4种脱氧核苷酸DNA聚合酶引物总结：胞内DNA复制的基本体系打开DNA双链提供DNA复制的模板合成子链的原料催化合成DNA子链使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸第二十九页，共七十三页，编辑于2023年，星期五一、PCR技术是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。第三十页，共七十三页，编辑于2023年，星期五（1）3′端和5′端：为了明确地表示DNA的方向，通常将DNA的羟基（—OH）末端称为________，而含____________的末端称为________；一个双链DNA分子中含两个3′端和两个5′端，如果一条链的方向是________，则另一条链的方向就是________，这就是反向平行的含义。3’端5’端磷酸基团5’→3’3’→5’1、PCR扩增方向第三十一页，共七十三页，编辑于2023年，星期五（2）DNA分子中相邻两个脱氧核苷酸残基通过________________相连，该化学键是由一分子脱氧核苷酸中3号碳原子上的羟基（—OH），与相邻的另一分子脱氧核苷酸中5号碳原子上的磷酸基团脱水聚合而成。所以DNA的合成方向总是从子链的________向________延伸。3’5’磷酸二酯键5’端3’端第三十二页，共七十三页，编辑于2023年，星期五第三十三页，共七十三页，编辑于2023年，星期五2、PCR技术原理（1）PCR：DNA分子在一定条件下可以进行________复制。（2）DNA的热变性原理：在________的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为________；当温度缓慢下降后，两条被分离的DNA链又会重新结合成双链，这个过程称为________。体外80-100℃变性复性第三十四页，共七十三页，编辑于2023年，星期五二、PCR的反应过程DNA模板与模板DNA两条链相结合的两种引物1、反应条件稳定的缓冲液环境四种脱氧核苷酸耐热的DNA聚合酶严格控制温度变化的控温设备第三十五页，共七十三页，编辑于2023年，星期五靶序列靶序列第一步：变性（90-95℃）2、反应过程第三十六页，共七十三页，编辑于2023年，星期五靶序列靶序列引物Ⅰ引物Ⅱ5’3’5’5’3’5’3’3’第二步：复性（50℃左右）第三十七页，共七十三页，编辑于2023年，星期五靶序列靶序列引物Ⅰ引物Ⅱ5’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNA聚合酶第三步：延伸（72℃左右）第三十八页，共七十三页，编辑于2023年，星期五靶序列

靶序列第1个PCR循环完成后：得到两个DNA分子第三十九页，共七十三页，编辑于2023年，星期五3、结果（P60页图5-9复制结果）（1）PCR的每一轮循环包括变性、复性和延伸三步，从第二轮循环开始，每次循环的产物也做模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸。这样，DNA聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的DNA序列呈____________。指数扩增第四十页，共七十三页，编辑于2023年，星期五（2）PCR一般要经历三十多次循环，处于两引物间固定长度的序列数目约为________。230第四十一页，共七十三页，编辑于2023年，星期五1、PCR仪（一）.设备及用具实质上一台能够自动调控温度的仪器。三、PCR的实验操作第四十二页，共七十三页，编辑于2023年，星期五2、微量离心管一种薄壁塑料管，总容积为0.5ml3、微量移液器用于定量转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次。第四十三页，共七十三页，编辑于2023年，星期五1.准备2.移液（二）实验操作步骤按照PCR反应体系的配方将所需用的试剂摆放在实验桌上。用微量移液器按照PCR反应体系配方往微量离心管里面加入各种试剂。混合后盖严微量离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁。3.混合（1）过程：将微量离心管放在离心机上,离心约10s。4.离心（2）离心目的：使反应液体集中在离心管底部，提高反应效果。第四十四页，共七十三页，编辑于2023年，星期五将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序。5.反应循环数变性复性延伸第一次94℃，5min－－30次94℃，30s55℃，30s72℃，1min最后一次94℃，1min55℃，30s72℃，1minPCR一般经历三十多次循环，每次循环可以分为三个基本步骤──变性、复性和延伸.第四十五页，共七十三页，编辑于2023年，星期五PCR技术高度灵敏，为了避免外源DNA等因素的污染而造成干扰实验，PCR操作时要注意做到：6.注意事项（1）隔离操作区，所用微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用必须进行高压灭菌；（2）分装试剂，简化操作程序，使用一次性枪头第四十六页，共七十三页，编辑于2023年，星期五（一）、理论上DNA扩增数目的计算三、课题成果评价1.一条DNA，复制n次，DNA为2n2.a条DNA，复制n次，DNA为a×2n（二）、实验中DNA含量的测定1.原理可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果，DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA的含量有关。2.过程（1）稀释2uLPCR反应液，加入98uL蒸馏水，即将样品进行50倍稀释.第四十七页，共七十三页，编辑于2023年，星期五以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零。取DNA稀释液100uL至比色杯中，测定260nm处的光吸收值DNA含量(g)＝50×(260nm的读数)×稀释倍数50：在标准厚度为1cm比色杯中，OD260为1相当于50g/mL的双链DNA分子（2）对照调零（3）计算（4）计算第四十八页，共七十三页，编辑于2023年，星期五光吸收波长／nm2602402202800.10.2第四十九页，共七十三页，编辑于2023年，星期五比色杯第五十页，共七十三页，编辑于2023年，星期五课题3血红蛋白的提取和分离第五十一页，共七十三页，编辑于2023年，星期五一、分离蛋白质的基本方法原理1、凝胶色谱法（分配色谱法）：a.凝胶：一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的通道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖，具多孔的凝胶就叫分子筛）

b.概念：根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用来进行分离。

第五十二页，共七十三页，编辑于2023年，星期五相对分子质量直径大小运动方式运动速度运动路程洗脱次序大____凝胶颗粒空隙直径，被排阻在____垂直向下移动____较短先从凝胶柱洗脱出来小____凝胶颗粒空隙直径，可以进入颗粒内部垂直向下移动，无规则扩散进入凝胶颗粒____较长后从凝胶柱洗脱出来大于凝胶外部快小于慢第五十三页，共七十三页，编辑于2023年，星期五第五十四页，共七十三页，编辑于2023年，星期五洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。大分子流动快小分子流动慢收集大分子收集小分子混合物上柱洗脱第五十五页，共七十三页，编辑于2023年，星期五2、

缓冲溶液的作用和组成：

（1）作用：能够抵制____________的对溶液___

的影响，维持pH基本不变。外界的酸或碱pH值(2)缓冲溶液的配制

通常由_______种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的_________就可以制得______________

使用的缓冲液。1--2比例在不同pH范围内第五十六页，共七十三页，编辑于2023年，星期五思考：在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是什么？它的目的是什么？使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的pH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察红色和材料的科学研究活性。第五十七页，共七十三页，编辑于2023年，星期五在同一电场下，由于各种分子带电性质（正电荷或负电荷）的差异及分子本身大小、形状的不同，而使带电粒子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。（2）原理：（1）概念：带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程3、电泳：第五十八页，共七十三页，编辑于2023年，星期五（3）常见方法琼脂糖凝胶电泳聚丙稀酰胺凝胶电泳第五十九页，共七十三页，编辑于2023年，星期五二、粗提取血红蛋白蛋白质的提取和分离一般分为四步：血液血浆血细胞白细胞血小板红细胞（最多）血红蛋白两个a－肽链两个β一肽链样品处理——粗分离——纯化——纯度鉴定第六十页，共七十三页，编辑于2023年，星期五第六十一页，共七十三页，编辑于2023年，星期五(1)目的：去除__________1、红细胞的洗涤杂质蛋白(2)方法：采集血样：为防止血液凝固，需在采血器中加入抗凝血剂柠檬酸钠

低速短时间离心：500r/min，离心2min，这样做的目的是防止红细胞与白细胞一同沉淀，达不到分离效果

吸去血浆：用胶头吸管吸去上层黄色血浆

：直至上清液中没有黄色，表明红细胞已经洗涤干净，否则需重复洗涤第六十二页，共七十三页，编辑于2023年，星期五

④生理盐水洗涤：向盛有暗红色红细胞液体的烧杯中加入五倍体积的生理盐水，缓缓搅拌10min

⑤低速短时间离心

⑥重复③④步骤3次：直至上清液中没有黄色，表明红细胞已经洗涤干净，否则需重复洗涤第六十三页，共七十三页，编辑于2023年，星期五（1）方法：加_________到原血液体积，再加40％体积的甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌10分钟。（2）目的：使红细胞吸水____，血红蛋白释放出来。涨破蒸馏水2、血红蛋白的释放（3）原理：渗透作用第六十四页，共七十三页，编辑于2023年，星期五3、分离血红蛋白溶液：