第十三章动物细胞详解

第十三章动物细胞详解演示文稿目前一页\总数四十八页\编于八点优选第十三章动物细胞目前二页\总数四十八页\编于八点第一节动物细胞融合技术自然融合频率很低，常采用诱导融合。诱导融合方法：病毒介导化学融合剂（PEG）电击（物理方法）原理及特点？目前三页\总数四十八页\编于八点一、病毒诱导融合1958年，日本的Okada发现紫外线灭活的仙台病毒可诱发艾氏腹水瘤细胞融合。进一步产生了第一个种间杂种细胞。目前仙台病毒广泛应用于动物细胞融合中。其他应用的病毒融合剂包括疱疹病毒、天花病毒和副粘液病毒等。目前四页\总数四十八页\编于八点一、病毒诱导融合1、原理：病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝集，细胞膜上的蛋白质分子和脂类分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。蛋白质分子重新分布：是细胞融合的必要前提脂质分子重排：是实现细胞融合的关键目前五页\总数四十八页\编于八点一、病毒诱导融合病毒灭活:是指用物理或化学手段杀死病毒，但是不损害它们体内的有用抗原的方法。灭活的病毒保留了诱导细胞融合的能力，又不会感染细胞。目前六页\总数四十八页\编于八点一、病毒诱导融合2、融合步骤先将亲本细胞分别制成悬液、混合离心将沉积细胞悬于1ml灭活的仙台病毒悬液，置冰浴间歇摇动20分钟，细胞凝集温度升至37℃，间歇摇动30分钟，使其进行融合将融合物悬浮于选择培养基进行培养目前七页\总数四十八页\编于八点二、聚乙二淳(PEG)诱导融合乙二醇：HO-CH2-CH2-OH聚乙二淳：HOCH2-（CH2-O-CH2）n-CH2OH用于诱导细胞融合的聚乙二醇的分子量为1500~7500之间，植物细胞一般为6000。诱导融合的原理及实验操作技术。目前八页\总数四十八页\编于八点（1）、聚乙二醇（PEG）法2、原理：细胞融合时细胞间必须紧密接触（质膜间的距离小于10Å），但正常细胞表面带负电荷而相互排斥。PEG可增加膜的流动性，并以自身带负电荷的醚键与带正电的水、蛋白质相互作用形成氢键介导细胞黏连。洗涤：打破了细胞表面的电荷平衡，使某些细胞的正电荷与另一些细胞的负电荷相互作用而促进融合。目前九页\总数四十八页\编于八点1、聚乙二醇（PEG）法（1）、融合原理-+-+-1PEG起桥梁作用++--2PEG被洗掉++--3电荷重排++--4膜接触++-5融合6融合细胞目前十页\总数四十八页\编于八点1、聚乙二醇（PEG）法融合液（植物细胞）：融合液A：CaCl2·2H2O（2~8mmol/L）融合液B：

CaCl2·2H2O（10~100mmol/L）

KH2PO4KH2PO4甘露醇（山梨醇）甘露醇（山梨醇）

PEG(50%)

pH（5.8）pH（7.0~10.0）融合液A过滤灭菌，融合液B高温灭菌。（2）、融合操作技术：首先要制备融合液和细胞悬液，然后进行融合操作。目前十一页\总数四十八页\编于八点二、PEG诱导融合动物、植物细胞融合的差异：PEG的分子量一般为1000~4000，30%~50%浓度PEG溶液pH为7.4~8.0（弱碱性），也有报导pH8.0－8.2时的融合率最高。处理方法：一般将逐滴加入PEG，温育后加入不含血清的培养基终止PEG的作用，洗涤细胞进行培养筛选。以5－15％的二甲亚砜或在融合前先用植物血凝素处理一下细胞，融合效率更高。目前十二页\总数四十八页\编于八点PEG法融合技术的特点融合频率高，可重复性好诱发融合无特异性：

植物+植物；植物+动物；动物+酵母毒性较低目前十三页\总数四十八页\编于八点三、电融合法电融合技术是20世纪70年代末80年代初建立的新的细胞融合技术。此法无毒害、效率高、操作简便但仪器昂贵。目前十四页\总数四十八页\编于八点融合过程及结果1膜融合（Ca2+、ATP、ATPase的参与）2融合数小时后细胞质混合3核融合（1）、融合过程目前十五页\总数四十八页\编于八点融合过程及结果（2）、融合结果核融合异核体杂种细胞双核融合对称融合（亲本双方）不对称融合（亲缘关系较远）全核+部分核一个核（胞质杂种）同核体（一个亲本）未融合（不成功）只有在第一次同步有丝分裂期间发生的核融合杂种细胞才能进一步发育。目前十六页\总数四十八页\编于八点四、融合细胞的筛选基于药物抗性筛选基于营养缺陷型筛选荧光标记筛选目前十七页\总数四十八页\编于八点1、基于药物抗性筛选药物抗性突变型：细胞突变后对某一种药物的抗性显著增加而形成的一种突变型。某一种药物在达到一定浓度时，可以杀死野生型细胞。当把正常的野生型细胞培养在含有这一药物的培养基上，逐渐增加药物浓度，便可得到一条存活曲线（surivalcurve）。但是存在一些自发突变，这一细胞在药物的致死浓度中仍能生长。目前十八页\总数四十八页\编于八点1、基于药物抗性筛选药物抗性突变型：0.1110100细胞活存率（log比例）野生型抗性突变型目前十九页\总数四十八页\编于八点1、基于药物抗性筛选在培养细胞药物抗性突变型中研究得最为广泛的药物抗性是氮鸟嘌呤抗性。氮鸟嘌呤是一种鸟嘌呤类似物（8-氮鸟嘌呤，8-AG和6-硫代鸟嘌呤，6-TG），当培养基中含有这一药物时，细胞就会由于其结构与鸟嘌呤类似而利用这一药物，将它掺入到细胞自身的DNA中，最终导致细胞死亡。目前二十页\总数四十八页\编于八点1、基于药物抗性筛选细胞内参与这一反应的一个重要酶称为次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（简称HGPRT，hypoxanthineguaninephosphoribosyl-transferase）。次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）：是细胞内嘌呤合成应急途径中的一种酶，它的作用是将次黄嘌呤和鸟嘌呤转变成次黄嘌呤核苷酸或鸟嘌呤核苷酸，后者参与DNA合成过程。氮鸟嘌呤抗性突变：细胞缺失HGPRT酶，即HGPRT-突变株。目前二十一页\总数四十八页\编于八点1、基于药物抗性筛选同理：5-溴脱氧脲嘧啶（5-BrdU）会引起细胞突变。参与这一过程的酶为胸腺嘧啶脱氧核苷激酶（TK）。胸腺嘧啶脱氧核苷激酶（TK）：利用胸腺嘧啶脱氧核苷合成DNA。是DNA补救合成途径中的一种重要酶。在5-BrdU选择下产生的5-BrdU抗性株，其特点为缺乏TK，即TK-突变株如LMTK–细胞系。目前二十二页\总数四十八页\编于八点1、基于药物抗性筛选DNA合成途径：

糖+氨基酸核苷从头合成途径（肝，能被氨基碟呤阻断）“补救”途径（脑和骨髓，包含HGPRT和TK酶）DNA目前二十三页\总数四十八页\编于八点补充资料：核酸的合成体内核苷酸的合成有两条途径：第一，由简单的化合物合成嘌呤环、嘧啶环的途径，称从头合成（denovosynthesis）途径。第二，利用体内游离的嘌呤、嘌呤核苷（嘧啶或嘧啶核苷），经过简单的反应过程，合成核苷酸，称为补救合成（或重新利用）（salvagepathway）途径。肝细胞及多数细胞以从头合成为主，而脑组织和骨髓则以补救合成为主。目前二十四页\总数四十八页\编于八点A9NNNN12346587腺嘌呤鸟嘌呤（1）嘌呤

G目前二十五页\总数四十八页\编于八点嘧啶N3N24561CTU尿嘧啶胞嘧啶H3C胸腺嘧啶(2)嘧啶目前二十六页\总数四十八页\编于八点从头合成途径目前二十七页\总数四十八页\编于八点补充资料：核酸的合成嘌呤这两个碳来在一碳单位，以四氢叶酸（辅酶F)为辅酶。氨甲喋呤为叶酸拮抗剂，可与二氢叶酸还原酶结合，阻碍四氢叶酸形成H3C胸腺嘧啶目前二十八页\总数四十八页\编于八点“补救”途径目前二十九页\总数四十八页\编于八点补充资料：核酸的合成嘌呤核苷酸补救合成途径：鸟嘌呤+PRPP鸟嘌呤核苷酸

次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）嘧啶核苷酸补救合成途径：胸腺嘧啶胸苷胸腺嘧啶核苷酸

胸腺嘧啶核苷酸激酶（TK）目前三十页\总数四十八页\编于八点1、基于药物抗性筛选筛选方法：将融合后的细胞在HAT选择培养基上培养。HAT选择培养基含:次黄嘌呤(hypoxanthine)氨基蝶呤（aminopterin）胸腺嘧啶（thymidine）亲本细胞：为HGPRT或TK缺陷型细胞目前三十一页\总数四十八页\编于八点2、营养缺陷突变型营养缺陷突变型是培养细胞突变型中的另一种重要突变类型。这些突变型表现在合成低分子量代谢物(如氨基酸）的能力发生了改变，以致这些细胞所产生的生物量不能满足正常生长的需要。例如氨基酸依赖型，嗜糖性突变型等目前三十二页\总数四十八页\编于八点2、营养缺陷突变型目前已分离得到许多与氨基酸、嘌呤、嘧啶等生物合成代谢有关的酶缺陷营养突变型。这些突变型的发现，不仅可用于研究不同生化途径中的生物合成过程和代谢调节作用，而且还能用来作为体细胞遗传学分析中的遗传标记。目前三十三页\总数四十八页\编于八点3、荧光标记筛选用不同荧光素标记的脂质染料标记亲本细胞。四乙基罗丹明橙色荧光异硫氰酸荧光素黄绿色荧光融合亲本发两种荧光或黄色荧光。也可用细胞分选仪分选。目前三十四页\总数四十八页\编于八点第二节单克隆抗体生产技术杂交瘤技术：将肿瘤细胞与体细胞融合获得杂种细胞的技术。杂交瘤技术多指B细胞杂交瘤技术。即将致敏的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行融合而产生杂种细胞，也有T细胞杂交瘤（胸腺瘤细胞）技术。它的目的主要是为获得淋巴因子或单克隆抗体。目前三十五页\总数四十八页\编于八点第二节单克隆抗体生产技术单克隆抗体技术：将正常的B淋巴细胞与缺陷型的骨髓瘤细胞融合，所得细胞在HAT选择培养基中培养，得到能分泌针对某一抗原的均质抗体的杂交瘤细胞（该细胞既可分泌抗体又可在体外大量增殖）。1975年，Kohler和Milstein制备了单克隆抗体，并于1984年获得诺贝尔生理学与医学奖。目前三十六页\总数四十八页\编于八点第二节单克隆抗体生产技术亲本选择及动物免疫骨髓瘤细胞选择细胞融合杂交细胞筛选杂交细胞的克隆培养单克隆抗体生产目前三十七页\总数四十八页\编于八点1、骨髓瘤细胞选择理想的杂交瘤细胞系具有下列特征：①能在体外连续生长，倍增期短于24小时；②缺乏HGPRT酶；③克隆效应高；④在动物中有致肿瘤性；⑤与小鼠淋巴细胞融合率相当高；⑥本身不合成Ig，且不抑制杂交瘤细胞中的Ig合成基因。目前三十八页\总数四十八页\编于八点1、骨髓瘤细胞选择常用骨髓瘤细胞系有：NS1、SP2／0、X63等。保存：防止突变、定期筛选（8-氮鸟嘌呤）防止支原体污染（胎牛血清）融合时保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于95％。目前三十九页\总数四十八页\编于八点2、亲本选择及动物免疫亲本：通常选用小鼠。正常供体和骨髓瘤细胞种系发生越近缘，产生的杂交瘤就越稳定(反之亦然)。因为融合用的小鼠骨髓瘤细胞大多数是从BALB/C纯系小白鼠取得，所以用BALB/C作脾细胞供体最为合适。

动物免疫：选用6-12周龄Balb/c小鼠，将可溶性抗原10-15ug/100ul+等量弗氏完全佐剂注射小鼠腹腔

2-4周后加强免疫（量减半，改用不完全佐剂，可反复多次）冲击免疫（融合前3天进行）目前四十页\总数四十八页\编于八点2、亲本选择及动物免疫免疫脾细胞悬液的制备：颈椎脱臼法处死小鼠无菌取脾脏

注射器内管挤压释放淋巴细胞1000r/min离心5min收集细胞0.91%NH4Cl4℃重悬细胞（破裂红细胞）加培养液终止NH4Cl作用离心收集细胞细胞计数目前四十一页\总数四十八页\编于八点3、饲养细胞的种类与制备（1）常用饲养细胞：①胸腺细胞,用量为106/0.2ml②正常的脾细胞；③传代培养中的大鼠胚胎成纤维细胞；④腹腔巨噬细胞：其用量为2×104/0.2ml，腹腔细胞是使用得最普遍的饲养细胞。（2）收集：饲养细胞一般在融合前一天制备，用平衡盐溶液（PBS）洗涤腹腔，离心收集后调整密度，培养于HAT培养基中。目前四十二页\总数四十八页\编于八点4、细胞融合（1）融合比例：

骨髓瘤细胞：脾细胞=1：5或1：10（2）融合剂：40%PEG（分子量1000-4000）（3）培养：融合24小时后加HAT培养液2周后改用HT培养液2周后用一般培养液目