DB65T 3704-2015规模化猪场口蹄疫防控技术规范

规模化猪场口蹄疫防控技术规范2015-01-19发布2015-02-19实施王涛(女)、王涛(男)、郭亚军、胡德江、左勇、杨启元、李建玲、庆永兴、周棕长、陈彪、王文秀、2 46.4.2商品猪(仔猪和育肥猪)28日龄～35日龄首免口蹄疫，58日龄～6670日龄前的免疫程序同商品猪，以后每隔4月～6月免疫一次口蹄疫疫苗。发生口蹄疫疫情时，要对疫区、受威胁区域的易感猪进行一次强化免疫，最近1个月内已免疫口蹄疫的和在免疫期内口蹄疫群体免疫抗体合格率达到70%的猪可以不强化免疫。种猪调运前21d进行猪口蹄疫强制免疫接种免疫猪应加施免疫标识(如佩戴二维码),并按照农业部的要求在专门的数据中心内录入免疫和耳建立免疫档案，记录内容包括：免疫日期、免疫猪群品种、年使用过的注射器具进行消毒，使用过的疫苗瓶和未用完的疫苗应进行无害化处理。免疫接种后，注意观察猪的反应。如猪出现体温升高、发抖、呕吐和减食等症状，一般1d～2d后可自行恢复；如有呼吸困难、震颤、惊厥抽搐、畜体僵直、晕可肌肉注射0.1%肾上腺素注射液0.2mL～1mL用以消除过敏性休克或肌肉内注射地塞米松磷酸钠5mg～10mg(怀孕猪不用)。疫苗反应的解决措施应符合NY/T1955的要求。对于不良疫苗反应造成猪死亡的，按照新疆维吾尔自治区有关7.1监测方法猪场兽医和饲养人员进行巡查制度，每天观察猪的精神状态、7.1.3血清学监测口蹄疫免疫28d后采集样品检测1次；对新购进的猪在并圈前，进行抽样检测。每次采样比例1%~5%,单次不少于20头份，每份血液样品量为5mL。样品的采集、保存和运送按照附录A的规定进行。灭活类疫苗采用液相阻断LpBELISAIHA口蹄疫合成肽疫苗采用VP1结构蛋白ELISA(见附录D)。病毒中和试验按照GB/T18935的要求操作，微量补体结合试验按照GB/T18935的要求操作。0型口蹄疫灭活类疫苗抗体正向间接血凝试验的抗体效价≥2判定为合格。合成肽疫苗VP1结构蛋白抗体ELISA的抗体效价≥2⁵判定为合格其他应符合NY/T1955的要求，群体免疫抗体合格率达到70%为群体免疫合格。整个猪场每季度采样检测1次，单次至少20头份。样品的采集、保存和运送按照附录A的规定进行。7,1,4.3检测方法非结构蛋白间接酶联免疫吸附试验(见附录F)。间接夹心酶联免疫吸附试验按照GB/T18935操作。反向间接血凝试验(RIHA)按照GB/T18935操作。7.2.1疑似口蹄疫病例8(规范性附录)口蹄疫病料的采集、保存与运送采集、保存和运输样品须符合下列要求，并填写样品采集登记表。A.1样品的采集和保存A.1.1组织样品A.1.1.1样品的选择用于病毒分离、鉴定的样品，以发病猪未破裂的舌面或蹄部、鼻镜等部位的水泡皮和水泡液最好。对临床健康但怀疑带毒的猪可在扑杀后采集淋巴结、脊髓、肌肉等组织样品作为检测材料。A.1.1.2样品的采集和保存水泡样品采集部位可用清水清洗，切忌使用酒精、碘酒等消毒剂消毒、擦拭。A.未破裂水泡中的水泡液用灭菌注射器采集至少1mL,装入灭菌小瓶中(可加适量抗菌素),A.剪取新鲜水泡皮3g～5g放入灭菌小瓶中，加适量(2倍体积)50%甘油/磷酸盐缓冲液(pH7.4),加盖密封；尽快冷冻保存。A.在无法采集水泡皮和水泡液时，可采集淋巴结、脊髓、肌肉等组织样品3g～5g装入洁净的小瓶内，加盖密封；尽快冷冻保存。每份样品的包装瓶上均要贴上标签，写明采样地点、编号、时间等。’怀疑曾有疫情发生的猪群，错过组织样品采集时机时，可无菌操作采集动物血液，每头不少于10mL。自然凝固后无菌分离血清装入灭菌小瓶中，可加适量抗菌素，加盖密封后冷藏保存。每瓶贴标签并写明样品编号，采集地点、时间等。通过抗体检测，做出追溯性诊断。A.1.3采集样品采集样品时要填写样品采样登记表。A.2样品运送运送前将样品进行封装和贴上标签，已预冷或冰冻的样品玻璃容器装入金属套筒中，套筒应填充防震材料，加盖密封，与采样记录一同装入专用运输容器中。专用运输容器应隔热坚固，内装适当冷冻剂和防震材料。外包装上要加贴生物安全警示标志。以最快方式，运送到检测单位。为了能及时准确地告知检测结果，请写明送样单位名称和联系人姓名、联系地址、邮编、电话、传真。送检材料必须附有详细说明，包括采样时间、地点、动物种类、样品名称、数量、保存方式及有关疫病发生流行情况、临床症状。ABCDEFGⅡ+抗原对照抗原对照抗原对照抗原对照CDEFGHABCDEFGHDB65/T3704—2015表B.296孔酶标板检测20份样品布局22+抗原对照抗原对照抗原对照抗原对照表B.396孔酶标板检测41份样品布局+抗原对照抗原对照抗原对照抗原对照B.2.10加底物：每孔加50μL底物溶液(含0.05%H₂O₂<3%质量浓度>的邻苯二胺OPD),37℃孵育15B.2.11加终止液：每孔加50μL终止液(H₂SO₄)。B.2.12酶标仪读数：15min内，将ELISA板置于酶标仪上，在492nm波长条件下读取吸光值。B.3结果判定a)病毒抗原对照平均ODgnm值在1.0～2.0范围内；b)阳性对照血清抗体效价在1:1024±1滴度以内；c)阴性对照血清抗体效价<1:8;试验结果同时符合上述条件，试验有效。病毒抗原对照平均OD492nm值50%计算。抗原对照是4孔，弃去最高和最低OD₄92nm值，计算剩余2孔的平均OD492nm值，再除以2,即50%对照值。该值即为临界值，表示阻断50%反应的对照OD₄92值。a)定量监测中：被检血清稀释孔0Denm值大于临界值的孔为阴性孔，小于或等于临界值的孔为阳性孔，阳性孔的ODgnm值等于临界值时所对应的稀释度为该份血清的抗体滴度。例如病毒抗原对照平均ODnm值为1.2,则其50%为0.6。某一待检血清在1:128时0Dgnm值为0.6,则该份待检血清的抗体滴度为1:128。若临界值处于两个滴度之间，如处于1:64与1:128之间，则抗体滴度取中间值为1:90;b)定性检测中，两个重复孔只要有一孔为阳性孔，则抗体滴度判定为1:64,两孔均为阳性孔，则判定为抗体滴度>1:64;c)ELISA抗体效价≥1:64,口蹄疫免疫抗体合格。(规范性附录)不见。若将抗原吸附(致敏)在经过特殊处理的红细胞表面，只需少量抗原C.3.8待检血清(每头约0.5mL血清即可)56℃水浴灭活30min。取1号待检血清50μL加入第1排第1孔，与稀释液混匀(避免产生过多的气泡),从该孔吸取50μL在血凝板的第7排第1孔加阳性血清50μL,2倍系列稀释至第10孔，混匀后从该孔取出50μL丢弃。C.4.4稀释阴性对照血清在血凝板的第8排第1孔加阴性血清50μL,2倍系列稀释至第4孔，混匀后从该孔取出50μL丢弃。此时阴性血清的稀释倍数依次为1:2(1)、1:4(2)、1:8(3)、1:16(4)。第C.4.5加血凝抗原被检血清各孔、阴性对照血清各孔、阳性对照血清各孔、稀释液对照孔均各加O型血凝抗原(充分摇匀，瓶底应无血球沉淀)25μL/孔。C.4.6振荡混匀将血凝板置于微量振荡器上2～3min,如无振荡器，用手依次四边轻拍混匀亦可，然后将血凝板放在白纸上观察各孔红血球是否混匀，不出现血球沉淀为合格。盖上玻板，室温下静置2h～3h判定结果，也可延至翌日判定。C.4.7判定标准试验成立条件：a)移去玻板，将血凝板放在白纸上，先观察阴性对照血清1:16孔，稀释液对照孔，均应无凝集(血球全部沉入孔底形成边缘整齐的小圆点),或仅出现“+”凝集(血球大部沉于孔底，边缘稍有少量血球悬浮),即阴性血清抗体效价≤1:16,稀释液对照孔无自凝现象；b)阳性血清对照1:2～1:256各孔应出现“++”～“+++”凝集为合格(少量血球沉入孔底，大部血球悬浮于孔内);即阳性血清抗体效价≥1:256;试验结果同时符合上述条件，试验有效。结果判定：在对照孔合格的前提下，再观察待检血清各孔，以呈现“++”凝集的最大稀释倍数为该份血清的抗体效价。例如1号待检血清1-5孔呈现“++”～“+++”凝集，6～7孔呈现“++”凝集，第8孔呈现“+”凝集，第9孔无凝集，那么就可判定该份血清的口蹄疫抗体效价为1:128。接种口蹄疫疫苗的猪群免疫抗体效价达到1:32(即第5孔呈现“++”凝集)为免疫合格。C.5.1性状C.5.1.1血凝抗原：摇匀呈棕红色(或咖啡色),静置后，血球逐渐沉入瓶底。C.5.1.2阴性对照血清：淡黄色清亮稍带粘性的液体。C.5.1.3阳性对照血清：微红或淡黄色稍混浊带粘性的液体。C.5.1.4稀释液：淡黄或无色透明液体，低温下放置，瓶底易析出少量结晶，在水浴中加温后即可全溶，不影响使用。C.6注意事项(规范性附录)猪口蹄疫结构蛋白(VP1)抗体ELISA试验D.1原理采用间接法测定标本中猪口蹄疫病毒VP1结构蛋白抗体(FMDV-VP1-Ab)水平。用纯化的抗口蹄疫病毒VP1结构蛋白抗体包被微孔板，制成固相抗原，与样品中口蹄疫病毒VP1结构蛋白抗体(FMDV-VP1-Ab)温育后，加入生物素标记的抗IgG抗体，再与链霉亲和素-HRP结合，形成免疫复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),与CUTOFF值相比较，从而判定标本中猪口蹄疫病毒VP1结构蛋白抗体适用于检测猪口蹄疫病毒O型VP1结构蛋白抗体。与猪口蹄疫病毒O型非结构蛋白ELISA抗体检测试剂盒联合使用，可区分口蹄疫O型病毒感染动物及疫苗免疫动物。D.3试验器材和试剂D.3.1猪口蹄疫病毒VP1结构蛋白抗原包被板、血清稀释板D.3.2微量可调移液器(单道、12道),取液塑咀D.3.3微量振荡器D.3.4生化培养箱或恒温培养箱D.3.6样品稀释液D.3.7浓缩洗涤液D.3.8酶结合物、酶结合物稀释液D.3.10终止液D.4试验方法D.4.1使用前将试剂盒恢复到室温，避免阳光直射或放置在30℃以上的环境中。孔作检测孔，每孔一个样品。D.4.3在稀释板的各孔中加入155μL样品稀释液。在相应各孔中分别加入5μL对照血清或被检血清样品。用加样器重复吹吸数次。稀释每个样品时必须使用不同的吸头。D.4.4取出抗原包被板。D.4.5分别从稀释板上取稀释后的对照血清和被检血清各100μL,加至抗原包被板的相应孔中，加盖或封膜后，置(37±2)℃下孵育(60±5)min。D.4.9每孔加入100μL酶结合物工作液，加盖或封膜后，置(37±2)℃下孵育(30±2)min。D.4.10重复D.4.7。D.4.12每孔加入100μLTMB底物工作液，加盖或封膜后，置(37±2)℃下孵育(15±1)min。D.5判定标准正常动物脱氧三磷酸鸟苷dGTP各1支。用DEPC-ddH₂O配制成2.5mmol/L,dNTP,方法是4种脱氧核苷27.5g甘油30.0mLE.2.1.5加800μL异丙醇。混匀后置-80℃,1h,或-30℃,4h以上(或过夜)。b)引物VP1A(5pmol/μL):5μL;c)