医学基础“三基”训练实验理论与技能分册

医学基础“三基”训练

实验理论与技能分册

北京老年病医疗研究中心

科研处编

首都医科大学宣武医院

200年

分子生物学

基本概念，基本理论

1、什么是分子生物学？

答：分子生物学是1945年由WilliamAstbury首次提出的，指的是对生物大分子的化学和物理结构的研究。

随着分子生物学的发展，它已渗透到各个学科，成为各学科领域的不可分割的部分。

2、生物大分子主要包括哪几类？

答：生物大分子主要有三类：蛋白质、核酸和多糖，它们分别是氨基酸、核甘酸和糖的多聚体，分子量相

当大（104•1012）»

3、蛋白质的基本概念是什么？

答：蛋白质是由若干个氨基酸构成的多聚物，也称为多肽。相邻的氨基酸之间通过肽键相连。蛋白质一端

具有一个游离的-Nh,称作氨基端或N端，另一端具有一个游离的-COOH,称作按基端或C端。

4、核酸的基本概念是什么？

答：核酸是由核甘酸组成的多聚物，每个核甘酸由下列三种成分组成：

（1）戊糖（五碳糖）：在RNA为核糖，在DNA为2,脱氧核糖。

（2）碱基：连接在糖的1'-碳原子上的啜吟碱基（腺噤吟A和鸟噤吟G）或喀陡碱基（胞喀陡C、胸

腺啥嚏T和尿啥嚏U）DNA和RNA都含AGC,T只在DNA中发现，U只在RNA中发现。

（3）磷酸基：磷酸基接在糖的5'碳原子上。

（1）和（2）组成核甘，核甘和磷酸组成核甘磷酸，即核甘酸。

5、多糖的基本概念是什么？

答：多糖是糖（最常见的是葡萄糖）的多聚物或糖的衍生物的多聚体。

6、决定蛋白质和核酸三维结构的非共价作用有哪些？

答：有氢键、疏水键、离子键、范德瓦耳斯键。

7、什么是DNA的一级结构？

答：DNA的一级结构是指DNA的核甘酸顺序。研究DNA的核甘酸顺序是进一步研究基因的结构、调控

及DNA高级结构的基础。

8、什么是DNA的二级结构？

答：DNA的二级结构分两类，一类是右手螺旋。如A、B、C型DNA,另一类是局部的左手螺旋，即Z-DNA。

9、什么是DNA的高级结构？

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答：DNA的高级结构也称超螺旋结构，是指DNA双螺旋链的扭曲。DNA的超螺旋结构使DNA处于能量

最低的状态。

10、筒述DNA的双螺旋结构(Watson-Crick模型)

答：DNA由两条链彼此盘绕形成双股螺旋，糖-磷酸骨架在分子的外侧沿螺旋轨迹运行，碱基在中央成螺

旋排列，一条链的碱基与另•条链的碱基氢键配对，形成噪吟与喀咤碱基对A-T和G-C。每一个碱基对的

两个碱基位于同一平面，垂直于螺旋轴，每相邻的碱基对旋转36℃,相距3.4A。因此每匝螺旋有10对碱

基，长34A。双螺旋的直径是20A。螺旋外部有两个螺旋形槽，深宽的称为大沟，浅窄的称为小沟。

11、简述DNA的碱基配对原则？

答：[A]=[T],[G]=[C],A-T之间有两对氢键，G-C之间有三对氢键。

12、什么叫DNA的变性？

答：双链DNA(或天然DNA)两条链之间的结合力遭到破坏，两条链分离成单链DNA的过程叫做变性。

通常用加热或高PH的方法使DNA变性。

13、什么是熔解曲线？什么是Tm值？

答：当DNA溶液通过加热变性时，其性质的变化与温度之间的关系图称为解链曲线或熔解曲线。

检测DNA变性的方法可以是测定DNA溶液在260nm波长处的紫外光吸收值[A260J,随温度的升高,A260

升高，当A260升高达到最大值一半时的温度，称作解链温度；用Tm表示。

14、什么是DNA的呼吸现象？

答：DNA双链的某些区域被打开变成单链的泡，这种现象称作DNA的“呼吸”，可使特定的蛋白质与DNA

分子发生相互作用和“阅读”它编码的信息。

A-T区比富含G-C区更容易发生呼吸。

15、什么是DNA的复性？

答:变性DNA溶液经处理后可重新形成天然DNA,这一过程称作变性或退火。

16、RNA主要有几种类型？各有什么功能？

答：RNA主要有三种类型：核糖体RNA(rRNA)、转移RNA(tRNA)和信使RNA(mRNA)。rRNA为

蛋白质的合成场所、tRNA是氨基酸的搬运工具，mRNA贮存编码信息。

17、什么是DNA的复制？

答：DNA以原来的分子为模板合成新的DNA分子的过程，叫DNA复制。

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18、什么是DNA的半保留复制？

答：DNA复制时首先双链之间氢键断开，以每条单链作为模板合成新链，因此新的DNA双螺旋，一条来

自亲代链、一条为新合成的子链。DNA的这种复制方式叫做DNA的半保留复制。

19、什么是复制叉和复制子？

答：DNA复制是由一个固定的起始点进行的，DNA双链在此点上解旋成双股单链呈叉形，称复制叉。-

般把一个生物体的单独复制单位称为一个复制子。一个复制子只含一个复制起点。

20、什么是拓扑异构酶？

答：拓扑异构酶能使DNA产生各种拓扑学的变化，最常见的是产生负超螺旋性和消除超螺旋性。多见的

有两类，拓扑异物酶I和拓扑异物酶II。

21、DNA复制的特点有哪些？

答：(1)半保留复制(2)忠实性(3)半不连续复制。

22、DNA复制过程中有哪几种聚合酶参与？有哪些共同点？

答：DNA聚合酶I(POII)和DNA聚合酶III(POLIII)在DNA复制过程中起作用。

其共同点是：

(1)同时要有带一个游离3,-0H基团的引物和一个模板。

(2)聚合作用是生长链末端的3'-0H基团与加上去的核昔-5-'三磷酸之间的反应。因此链的生长是

自5'f3'方向进行的。

23、P0LI有哪些生物活性？

答：(1)5,-3Z聚合酶活性：使DNA复制进行。

(2)3'-5'外切酶活性：可以切除误配对的碱基，也称poll的校对功能。

(3)5'->3'外切酶活性：主要功能是切除核糖核甘酸引物。

24、POL川具有哪些生物活性？

答：

(1)5,一3,聚合酶活性：DNA复制的主要聚合酶。

(2)3'-5,外切酶活性：DNA复制中起校对功能。

25、什么是DNA连接酶？

答：DNA连接酶能把3'-0H基因与5,-P基因相连接，在DNA复制过程和其他重要过程中发挥作用。

26、什么是DNA的不连续复制：什么是冈崎片段?

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答：DNA复制时，在不同点形成许多小片段，再连接成整链，这称作DNA的不连续复制，这些小片段称冈

崎片段。

27、什么是DNA的0复制？

答：大部分DNA分子以环状结构进行复制，这些环像希腊字母。，所以习惯称其为。复制。环复制引起的

拓扑学问题靠DNA促旋醐来解决。

28、DNA复制起始时前导链或引物的合成是由什么酶催化完成的？

答：一种是RNA聚合酶，另一种是引物合成酶。

29、DNA复制起始时双螺旋的解链是山什么酶催化完成的？

答：解旋酶。

30、什么是ssb蛋白？

答：大肠杆菌DNA复制时，为了避免单链区退火或形成链内氢键，有一种蛋白结合在单链DNA匕称单链

结合蛋白(ssbprotein)。

31、简述大肠杆菌DNA的复制过程？

答：解旋酶由ATP水解所驱动，并可能借助于ssb蛋白的结合把螺旋解开。不配对的碱基为ssb蛋白所覆

盖。前导链由polHI催化加上核甘酸而沿着一条亲链前进。DnaB蛋白复合物沿另一条亲链移动，预引发它

使引物合成酶合成引物RNA。polHI把核甘酸加到引物匕从而合成了前体片段。这种合成继续到前一个前

体片段的引物；这时由polI取代polIH,通过切口平移除去RNA,并山DNA取代，RNA一旦除去，DNA连

接酶就封闭切口，从而使前体片段参入后随链。复制又继续前进直至完成复制。

32、DNA复制的起始有哪两种方式？

答：(1)全程起始：其中前导链从头开始。

(2)共价延伸：其中前导链共价连接到亲链。

33、DNA复制主要有哪种方式？

答：(1)线性DNA双向复制。

(2)环状DNA。型复制。

(3)环状DNA滚环复制。

(4)环状DNAD-环复制。

34、什么是D环？

答：在DNA复制的全程起始中，前导链的合成先于后随链的合成。在第一个前体片段合成开始前，存在

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着一个复制泡，是由一个双链分去（由一条亲链与前导链配对而成）和一个单链分去（是未复制的第二条

亲链）所组成。因为前导链置换了未复制的亲链，所以这个泡称为置换环或D环。

35、什么叫滚环复制或S复制？

答：DNA双螺旋环产生一含3'-0H和5'-P末端的切口，在解旋酶和ssb影响下，形成一复制叉。前导链

的合成从3,-0H端开始延伸，并与后随链的亲链共价连接。后随链以新合成的前导链为模板合成。这­

复制模式的结果是产生带有线状分去的环，类似于希腊字母6,被称为6复制或滚环复制。

36、什么是双向复制？

答：DNA分子通过两个复制叉沿着环按相反方向移动，称为双向复制。

37、真核生物DNA的复制与原核生物DNA复制的相同点和不同点有哪些？

答：相同点：都是半保留复制，半不连续复制，复制过程都存在引发、延长和终止三个阶段，都必须有相

应功能的蛋白质（如ssb）和醐（如DNA聚合酶）参与等等。

相异之处在于：（1）真核生物每条染色质上可以有多处起始点，而原核生物的起始点只有一个，（2）真

核生物的染色体在全部复制完成之前，各个起始点上DNA的复制不能再开始；而原核生物在起始点上可以

连续地开始新的DNA复制，表现为虽有一个复制子，但可有多个复制叉。

38、真核细胞中存在哪几种DNA聚合酶？

答：在真核细胞中存在四种DNA聚合酶，通常将这些醐依次称为DNA聚合酶a、B、y和线粒体DNA聚合

的。其中a酶在细胞内DNA复制中起关键作用，B前在DNA损伤修复中起作用，Y酶在分裂细胞的DNA复

制调控方面起作用。

39、DNA复制的调控有哪几方面？

答：（1）复制起点的调节：通过复制起点区反转重复顺序的变构与一些特异蛋白结合来调节复制的方向、

速度等。

（2）起始蛋白的调节：起始蛋白与DNA起始部位的结合，导致局部结构变化，从而引起DNA复制。

（3）复制过程的调节：DNA复制过程中常受到一些蛋白及DNA聚合酶的调节。

（4）复制频率的调节：每种生物体DNA复制与其细胞周期有关。如真核生物每个细胞周期有一次全

DNA的复制，而原核生物中某些质粒在细菌细胞一个细胞周期中可以复制若干拷贝。

（5）生物膜可能参与DNA复制的起始过程。

40、引起DNA分子改变的原因有哪些？

答：有3种机制改变DNA的结构：（1）复制过程中的碱莽置换；（2）由碱基或N-糖糖键固有的化学不稳

定性所引起的碱基变化：（3）其他化学物质和环境因素的作用所引起的变化。

41、DNA分子改变的类型有哪几种？

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答：

(1)碱基置换：山于复制过程中校对功能的遗漏，基自发脱氨作用使嘴啜变为尿喀脏或使腺噂吟变为

次黄噂吟，使一条链上的错误碱基不能与另•条链的相应碱基形成氢键。

(2)碱基丢失：喋吟核甘酸的N-糖首键在生理温度下自发断裂，使喋吟从DNA上脱落，这一过程称

为脱喋吟作用。

(3)碱基改变：许多化学试剂和物理因素能使碱基变成截然不同的化合物。如紫外线照射形成的胸腺

喀咤二聚体。

(4)单链断裂：许多试剂能裂解磷酸二酯键，如过氧化物、硫基化合物和某些金属离子(如Fe?+和Cu2+)

单链断裂往往通过DNA连接酶的作用来修复。

(5)双链断裂：足够多的单链断裂可使双链彼此相对，结果就出现双螺旋断裂。双链断裂往往不能修

复。

(6)交联：某些抗生素(如丝裂霉素C)和某些试剂(亚硝酸离子)能使DNA分子一条链上的碱基与

互补链上的相应碱基形成共价连接。

42、胸腺喀嚏二聚体的修复途径有哪些？

答：有4条途径：①光修复②切割修复③重组修复④SOS修复。

43、什么是转录？

答：遗传信息从DNA分子传递到RNA分子的过程叫转录。

44、RNA的合成包括哪几个阶段？

答：RNA的合成包括4个阶段：①RNA聚合酶结合在模板的特定部位上②起始③链延伸④链终止和

释放。

45、RNA合成的基本特性是什么？

答：

①RNA合成的前体是4种5'-核昔三磷酸(rNTP)即ATP,GTP,CTP和UTP。

②在聚合反应中，一个核甘酸上的3'-0H基因与第二个核甘酸上的5,磷酸基团发生反应，释放出焦磷酸

二酯键。

③RNA分子的碱基顺序由DNA的碱基顺序所决定。A-U,T-A,G-C,C-G。

④DNA分子的双链中，只有一条链作模板。

⑤RNA链按5'-3'方向延伸。

⑥RNA聚合酸能起始链的生长，也就是说，它不需要引物。

46、大肠杆菌RNA聚合醐由哪儿个亚基组成？

答：由5个亚基组成，2个相同的a亚基，6,6'和6亚基各1个。完整的酶称为全酶，不含6亚基的

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酶称为核心酶。

47、什么是Pribnow顺序?什么是“保守的T”？

答：大肠杆菌DNA转录起始时，拷贝出的mRNA的第一个碱基左侧的5-10个碱基区域是Pribnow顺序的右

末端，其全部顺序都可认为是基本顺序TATAATG的变式。黑体的T是Pribnow顺序中的第6个碱基，在至

今定序的所有启动子中都有这碱基，因此被称作“保守的T”，通常把保守的T垂直对齐即可比较不同的

顺序。Pribnow顺序被认为是给RNA聚合酶取向的顺序，使从左到右进行合成；它也是打开双螺旋形成开

放启因子复合物的区域。

真核生物中相应的一致顺序是TATAAAA,称TATA顺序或Hogness顺序。

48、什么是-35顺序?

答：真核生物启动子中，拷贝出的mRNA的第个碱基左侧第35个碱基位置有9个碱基的区域，被认为

是RNA聚合酶结合的起始点，习惯称作-35顺序。

49、什么是开放启动复合物(Open-promotercomplex)?

答：开放启动复合物由RNA聚合酶和启动子结合形成，是一种高度稳定的复合物，是链起始中的活性中间

物。在这个复合物中，DNA双螺旋的局部松开(“解链”)从Pribnow顺序左侧的10个碱基开始一直扩展到

转录的第一个碱基部位。这种解链是进入的核甘酸进行配对所必需。

50、RNA聚合前起始部位结合哪种核甘三磷酸？

答：只结合喋吟核昔三磷酸，即ATP和GTP。其中之■(往往是ATP)是链中的第一个核甘酸。

51、RNA合成的终止顺序有什么特征？

答：RNA合成的终止发生在DNA分子的特定碱基顺序上，它们有三个重要区域：

(1)第一区域是中央含非重复片段的反向重复碱基顺序;如ABCDEF-XPZ-F'E'DzCB'AS其中A-A'、

B-Bz等是互补的碱基。因此这个顺序能在链内碱基配对，在RNA转录物中和可能在DNA链中形成

茎环结构。

(2)第二个区域是在茎的近环端(有时全在茎内)，是一个G+C富集的顺序。

(3)第三个区域(有时不存在)是A-T配对的顺序，使RNA中产生6-8个尿口密咤，其后往往跟随一个

腺噂吟。

52、什么是3循环？

答：RNA合成过程中，链延伸约8个核甘酸时，RNA聚合酶结构改变，6亚基脱落；当合成终止时，核心

酶从DNA上解离，核心酶与6亚基重新结合形成全酶。这一过程称6循环。

53、什么是有义链和反义链?

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答：DNA转录成RNA时，只有双链中的一条链转录，这条链就叫有义链。未被转录的DNA链称为反义链。

54、什么是顺反子(Cistron)?

答：相应于一条多肽链的DNA片段加上起始信号和终止信号，被称作顺反子。编码单个多肽的mRNA称作

单顺反子mRNA;编码不同的多肽链的mRNA称作多顺反子mRNA。

55、什么是前导区(Leader)?弱化子(attenuator)?间隔顺序(spacer)?

答：mRNA分子编码区之前的非翻译区段称为前导区。前导区中含有调节蛋白质合成速度的调节区，称为弱

化子。多顺反子mRNA分子可能含有顺反子间顺序，长达几万个碱基，称间隔顺序(spacer)。

56、核糖体RNA(rRNA)和转移RNA(tRNA)经过转录后修饰后有哪些性质？

答：rRNA和tRNA经过转录后修饰或加工具有下列3个性质：

①分子的末端为5,-单磷酸，而非初级转录物的末端三磷酸；

②rRNA和tRNA分子比初级转录物小得多；

③所有tRNA分子都含有A,G,C,U以外的碱基，这些所谓的“稀有”碱基并不存在于初级转录物中。

57、真核生物与原核生物转录有什么区别？

答：真核生物中的转录和mRNA的基本特性与细菌中的相类似，然而有下列5个明显的区别。

①真核生物细胞含3大类核内RNA聚合酶，负责各类RNA的合成。

②许多mRNA是长寿的。

③5'和3'末端都受到修饰：5'末端形成“帽子(CAP)结构"，3'末端有一多聚腺甘酸顺序(Poly(A)

)。

④用作蛋白质合成的mRNA模极只占初级转录物的1/10,在mRNA加工过程中，切除称为内含子(intron)

的内插顺序，留下的片段重新连接。⑤所有真核生物的mRNA分子都是单顺反子。

58、真核生物RNA聚合醐有儿类，分别参与哪种RNA的合成？

答：真核生物含3类RNA聚合前，分别以I、II、IH表示。第I类存在于核仁内，参与rRNA的合成；第

II类存在于核质内，参与mRNA的合成；第IH类存在于核质内，参与tRNA和5sRNA的合成。

59、什么是真核生物mRNA的帽子结构？

答：真核生物mRNA分子的5'-端有甲基化的鸟背衍生物7-甲基鸟苜(7-MeG),呈异常的5'-5'链连到

5'端核甘酸上，偶尔相邻核甘酸的糖也被甲基化。7-(MeG)-5'-ppp-(G或A,可能甲基化的核糖)-3'

-P-,这一结构被称为帽子(Cap),其中，P和PPP分别代表单磷酸和三磷酸基因。帽子的功能可能是保护

mRNA免受核酸酶的降解、或为蛋白质合成提供识别特征。

60、什么是RNA的拚接(RNASplicing)?

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答：真核生物mRNA分子中内含子切除和外显子连接成成熟mRNA分子的过程，称作RNA拚接。

61、什么是断裂基因？

答：由于基因中有内含子，使编码一个蛋白质或多肽的DNA顺序在基因上呈不连续状，称断裂基因。

62、什么是翻译（translation）?

答：细胞内DNA指导蛋白质合成的过程叫做翻译。包括编码和蛋白质合成两步。编码就是将DNA的碱基顺

序翻译成肽链的氨基酸顺序。蛋白质合成包括合成起始、链的延伸终止、释放、折叠及合成后修饰过程。

63、什么密码子？有哪些特点？

答：密码子是指对应于各种氨基酸的mRNA分子上的碱基顺序，通常由3个碱基组成，密码子有下述特性:

①通用性：在所有生物中，密码子-氨基酸关系都是相同的（线粒体、叶绿体除外）；②简并性：编码同一

氨基酸的密码子往往不止一个（甲硫氨酸和色氨酸除外），它们往往只是第3个碱基不同；③起始密码子

标志着肽链合成的起始，即AUC,编码甲硫氨酸；④终止密码子，3种密码子标志着肽链合成的终止，即

UAA,UAG和UGA。

64、什么是解码作用？

答：解码作用是把mRNA分子中的碱基顺序变成翻译到蛋白质分子中的氨基酸顺序，这是由mRNA分子和氨

酰tRNA合成酶完成的。

65、简述tRNA分子的二维结构特征？

答：tRNA分子的二维结构类似平面的三叶草形，包括以下几个结构区：

①受体臂：3'-0H端有一个4碱基组成的单链区，顺序为CCA-3'-011,称CCA或受体臂，其中A为氨基

酸结合部位。

②有三个大的单链环。（a）反密码子环：含有反密码子，由3个碱基组成，与mRNA中的密码子顺序进行

碱基配对。（b）二氢尿喀咤环（DHULOOP）：含有二氢尿口密咤。（c）TWC环：含有『W-C顺序；¥为假尿

喀咤。

③有四个称为干（臂）的双链区.

④有一额外臂（extaarm）。

66、什么是摇摆假说（wobblehypothesis）?

答：摇摆假说是用来解释某些tRNA分子对应于几种密码子的现象。这种假说认为，因为反密码子位于单

链RNA环中，密码子-反密码子相互作用也许不需要形成双螺旋常见的空间结构，这样对密码子的第三个

位置上的碱基要求是不太严格的，这样通过结构的稍稍摇摆，在密码子和反密码子之间可以存在其他的碱

基对如AT,U-I,C-I和G-U等等，这样就解释了--种tRNA分子可对应于几种密码子。也就是说，密码

子的简并现象是由密码子第三个碱基配对时摇摆引起的。

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67、什么是重叠基因（orerlappinygene）?

答：一个DNA片段含有多重读框，从而编码多种不同的蛋白分子，这种现象称重叠基因。

68、肽链合成分哪几个阶段？各阶段主要特征是什么？

答：肽链合成分三个阶段：①起始阶段：mRNA结合到核糖体匕选择起始密码子，和携带第一个氨基酸的

酰化tRNA结合；②延伸阶段：通过肽键把两个氨基酸相连，mRNA和核糖体彼此相对移动，使密码子能成

功地翻译。③终止阶段：合成好的蛋白质从合成机构上解离，释放出核糖体开始另一轮合在成。

69、筒述大肠杆菌核糖体的结构？

答：大肠杆菌核糖体的完整颗粒称为70s核糖体（S为沉降速率），含两个亚基，分别为30s和50S。每个

30S亚基含1个16SrRNA分子和21种蛋白质；第个50S亚基含2个rRNA分子（1个5srRNA分子和1个

23SrRNA分子）和32种蛋白质。

70、什么是Shine-Daigarno顺序？

答：在原核生物mRNA分子中有一特定的碱基顺序AGGAGGU,能够识别作为起始信号的特定AUG密码子，称

作Shine-Dalgarno顺序或核糖体结合部位。

71、什么是30s前起始复合物和70s起始复合物？

答：细菌中多肽合成由30s亚基、mRNA分子、f'Met-tRNA、起始因子以及GTP一起组成30s前起始复合物,

再与50S亚基连接形成70s起始复合物。

72、什么是质粒？质粒有哪些基本特性？

答：质粒是独立于细菌染色体之外的•些双链闭环的DNA分子，是能够进行复复和遗传的辅助性遗传单位,

其大小范围从1Kb至200Kb以上不等。质粒的基本特性如下：

（1）复制能力和不相容性：质粒DNA能够依赖于宿主编码的酶和蛋白质来进行复制和转录。利用同•

复制系统的不同质粒不能稳定的和平共处，可称之为不相容质粒。当两个上述质粒被导入同一细

胞时，它们在复制及随后分配到子细胞的过程中彼此竞争，细胞生长几代后，占少数的质粒将会

丧失殆尽。

（2）转移性：在自然条件下，很多质粒都可以通过一种称为细菌接合的作用转移到新宿主内。

（3）选择性标记：质粒能够编码一些可识别性表型，称作可选择标记。最常用的可选择标记是抗生素

抗性基因，所涉及的抗生素包括氨芳青霉素、四环素、氯霉毒和卡那霉素（或新霉素）等。

73、质粒DNA小量制备过程中容易出现的问题及对策有哪几种？

答：

（1）质粒DNA不能被限制前所切割，主要是由于从细菌沉淀或从核酸沉淀中去除所有上清液时注意得

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不够。大多数情况下，用酚氯仿对溶液进行抽提可以去除小量制备物中的杂质。若问题依然存在,

可用离心柱层析法纯化DNAo

（2）个别小量制备物会出现无质粒DNA的现象，这几乎肯定是由于核酸沉淀颗粒已同乙醇一起被弃去。

74、在大量制备质粒DNA过程中，可通过什么方法来提高质粒的产量？

答：将细菌在丰富的培养基中37℃振摇一定时间（约25小时），所得培养物的0优。。达到约0.4,此时加氯

霉素溶液，使终浓度为170ug/ml,于37℃剧烈振摇，继续培养12-16小时。

75、用于去除质粒DNA中RNA的酶的名称是什么？一般工作浓度是什么？

答：核糖核酸酶A,习惯称无DNA酶的胰RNA酶。一般工作浓度为20ug/ml。

76、影响外源DNA片段和质粒载体连接的因素有哪些？

答：（1）外源DNA片段末端的性质，见下表：

外源DNA片段所克隆的要求说明

带末端

平端要求高浓度的DNA和连接酶①非重组体克隆的背景可能较高

②质粒和外源DNA接合处的限制酶切位

点消失

③重组质粒会带有外源DNA的串联拷贝

不同的突出端用两种限制酶消化后，需纯化质①质粒与外源DNA接合处的酶切位点常

粒载体以昼提高连接效率可保留

②非重组体克隆的背景较低

③外源DNA只以一个方向插入到重组质

粒中

相同的突出端线状质粒DNA常用磷酸酶处理①质粒与外源DNA接合处的限制酶切位

点常可保留

②外源DNA会以两个方向插入

③重组质粒会带有外源DNA的串联拷贝

（3）质粒载体和外源DNA中限制酶切位点的性质：有两种方案可以解决质粒与外源DNA限制酶切位

点的不匹配：A.在线状质粒的末端和（或）外源DNA片段的末端接上合成的接头或衔接头；B.控

制反应条件，用大肠杆菌DNA聚合酶IKlenow片段部分补平带3'凹端的DNA片段。

77、对于常规的连接反应来讲，质粒DNA与外源DNA的比率应为多少？

答：对于常规的连接反应，质粒DNA与外源DNA的比率应〈1,这样将可得到数量相宜的有效重组体。

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78、平端DNA的连接需要哪些基本条件？

答：平端连接是低效反应，它要求以下4个条件：

（1）低浓度（0.5mmol/l）的ATP；（2）不存在亚精胺一类的多肽；（3）极高浓度的连接酶（50Weiss

单位/ml）；（4）高浓度的平端。

79、在平端DNA连接时，常常在反应混合物中加入凝聚剂，常用的有哪些？它们的作用是什么？

答：在平端DNA连接时一，常常在反应混合物中加入一些可促进大分子群聚作用并可导致DNA分子凝聚成聚

集体的物质，常用的有聚乙二醇和氯化六氨合高钻。在连接反应中，这些物质具有两个作用：

（1）它们可使平端DNA的连接效率加大1-3个数量级，因此可使连接反应在酶和DNA浓度不高的条件

下进行。

（2）它们可以改变连接产物的分布，分子内连接受到抑制，所形成的连接产物一律是分子间连接的产

物。

80、影响转化效率的因素有哪些？

答：下述3个因素对于获得持续高的转化效率来说是至关重要的：

（1）转化缓冲液中试剂的纯度：务必使用所能得到的最高质量的试剂，这些试剂应分装成小份，避光

保存于冷处。

（2）细胞的生长状态：由于一些不清楚的原因，直接用贮存于-70℃冰冻培养基中的贮存原种接种而进

行培养的细菌，所得到的转化效率最高，不应使用在实验室中连续传代，贮存于4℃或贮存于室温

的培养物。

（3）玻璃和塑料器皿的清洁度：痕量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大地降低细菌的转化效率,

所以最好拔出一批玻璃器皿专用于制备感受态细菌，而不作它用。这些玻璃器皿应用手洗刷，再

灌满纯水（Milli-Q级或其相当的级别），然后高压灭菌，临用前才把水倒掉。

81、鉴定含重组质粒的细菌菌落的方法有哪些？

答：常用4种方法来鉴定含重组质粒的细菌菌落:

（1）小规模制备质粒DNA进行限制酶切分析；

（2）a互补

（3）插入失活

（4）杂交筛选

82、简述a-互补的原理？

答：现在使用的许多载体（如PUC系列）都带有一个大肠杆菌DNA的短片段，其中含有*半乳糖甘酶

基因（lacZ）的调控序列和头146个氨基酸的编码信息。这个编码区中插入了一个多克隆位点，它并不破

坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到半乳糖甘酣的氨基端，而不影响功能。这种载体适用于可编码

B-半乳糖首酶C端部分序列的宿主细胞。虽然宿主和质粒编码的片段各自都没有酶活性，但它们可以融

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为一体，形成具有酶学活性的蛋白质。这样lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操

纵基因区段的6-半乳糖甘酶阴性的突变体之间实现互补，这训互补现象叫a互补。由a互补而产生的

lac+细菌易于识别，因为它们在生色底物5-溟-4-氨-3』引味-B-D-半乳糖甘（X-lac）存在下形成蓝色菌落，

然而外源DNA片段插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致产生无a互补能力的氨基端片段。

因此，带重组质粒的细菌形成白色菌落。这一简单的颜色试验大大简化了在这种质粒载体中鉴定重组体的

工作，通过目测即可识别可能带有重组质粒的菌落。

83、X噬菌体的复制方式有哪几种？

答：X噬菌体有下述两种复制方式：

（1）在裂解性生长过程中，环状病毒DNA分子被复制了许多倍，X噬菌体基因产物大量合成，并组装

成子代X噬菌体颗粒，最终宿主细胞裂解，释放出许多感染性颗粒。

（2）在溶源性生长过程中，X噬菌体基因组通过位点专一重组整合入宿主菌DNA分子中，随宿主菌DNA

复制并转入子代细菌中。在溶源状态下，只有一个X噬菌体基因，即CI基因，处于表达状态，

它编码一个阻抑物。

84、X噬菌体载体有哪两种类型？

答：

（1）只有一个限制酶切位点可供插入入源DNA的载体，称作插入性载体。

（2）在可被外源DNA置换的X噬菌体DNA非必需区两侧有一对限制酶切位点的载体称作置换性载体。

85、简述Agt11载体的特征。

答：Xgt11载体是一个常用的，可用于免疫学筛选的载体。DNA片段（可达7.2Kb）插入lacZ内的单一

ECORI位点，如果插入片段的读框与lacZ的读框相吻合，就可表达出融合蛋白。该载体需要SupF宿主

菌进行增殖和筛选。在非抑制性宿主菌内，由于Sam100突变的存在可以防止细菌裂解，所以表达的融合

蛋白就会在细菌内累积。该载体带有red和gam基因，可以在recA-宿主菌内生长。载体上的温度敏感阻

抑物可用来控制筮菌体的复制和融合蛋白的表达。

86、X噬菌体大规模制备的方法有哪两种？

答：大规模制备X噬菌体有下述两种方法：（1）低复数感染；（2）高复数感染。

87、纯化X噬菌体的方法有哪几种？

答：（1）氯化葩梯度离心；（2）沉淀噬菌体颗粒；（3）甘油分级梯度离心；（4）氯化钠平衡离心。

88、用A噬菌体进行克隆包括哪些步骤？

答：用人噬菌体进行克隆包括5个步骤：

（1）用适当限制酶消化的载体DNA的制备；

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(2)酶切的载体与带匹配粘端的外源DNA片段的连接；

(3)将连接的DNA包装入噬菌体颗粒中，在适当的宿主菌上形成噬斑；

(4)带有目的外源DNA序列的X噬菌体重组体的鉴定；

(5)对选出的重组噬菌体进行噬斑纯化，然后进行外源DNA的分析。

89、大肠杆菌丝状噬菌体有哪儿种？它们有什么用途？

答：大肠杆菌丝状噬菌体包括M13噬菌体、fl噬菌体和fd噬菌体。这些噬菌体均含一个约6400个核甘酸

的单链闭环DNA分子。在用作克隆载体时，这些噬菌体有一个得天独厚的优点，即可以产生大量含有外源

DNA某一条链的DNA分子。这种单链DNA分子可以在下列工作中用作模板：

(1)用双脱氧链终止法进行DNA序列测定

(2)制备仅有一条链得到放射性标记的杂交用DNA探针

(3)利用寡核甘酸进行定点诱变。

90、什么是限制性内切酶？分儿类？

答：限制性内切的是指能特异性地结合于一段特殊DNA序列之内或其附近的特异位点上，并在此切割双链

DNA的一类蛋白质。它可分3类。I类和IH类限制酶在分子克隆中不常用，常规应用于分子克隆中的限制

酶为H类。

91、什么是同裂酶？

答：不同来源的限制醐可切割同一靶序列，这些醐即称为同裂酶。

92、大肠杆菌DNA聚合酶I有哪些活性？在切口平移法标记DNA时利用的是哪一活性？

答：DNA聚合酶I具有3种活性：(1)5,一3,DNA聚合酶活性；(2)5,-3Z外切核酸酶活性；(3)3,

-5'外切核酸酶活性。在切口平移法标记DNA中利用的是其5,一3'外切核酸醵活性。

93、什么是大肠杆菌DNA聚合酶I大片段(Klenow段)？在分子克隆中有哪些用途？

答：利用蛋白酶解作用(如枯草杆菌蛋白酶)去除大肠杆菌DNA聚合酶I的5,一3'外切核酸酶活性，而

聚合酶活性3'-5'外切核酸酶活性切不受影响。这种经蛋白酶作用后的DNA聚合酶I就叫做DNA聚合酶

I大片段或Klenow片段。

用途：(1)补平限制酶切割切割DNA产生的3'凹端。

⑵用[32P]dNTP补平3'凹端;对DNA片段进行末端标记;

(3)对带3'突出端的DNA进行末端标记；

(4)在cDNA克隆中，用于合成cDNA第二链；

(5)在体外诱变中，用于从单链模板合成双链DNA；

(6)应用Sanger双脱氧末端终止法进行DNA测序；

(7)消化某些限制酶作用后产生的3,突出端；

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(8)也可用于聚合酶链式反应(PCR)o

94、T,噬菌体DNA聚合酶的用途有哪些？

答：(1)补平或标记限制酶消化的3'凹端；

(2)对带有3'突出端的DNA分子进行末端标记；

(3)标记用作探针的DNA片段；

(4)将双链DNA的末端转化成平端；

(5)使结合于单链DNA模板上的诱变寡核甘酸引物得到延伸。

95、什么是测序酶(Sequenase)?

答：测序酶是经修饰的「噬菌体DNA聚合酶，其99%以上的3,一5,外切核酸酶活性由氧自由基介导的位

点特异性修饰作用而灭活，但其聚合能活性则无明显改变，它是用双脱氧链终止法对长段DNA进行测序的

理想用酶。

96、什么是TaqDNA聚合酶？其用途有哪些？

答：TaqDNA聚合酶是一种耐热的依赖于DNA的TagDNA聚合酶(分子量65000D)它最初是从极度嗜热的

栖热水生菌Thermusaquaticus中纯化而来的。

TaqDNA聚合酶可用于对DNA进行测序及通过聚合酶链式反应对DNA分子的特定序列进行体外扩增。

TaqDNA聚合酶作用时需要Mg";磷酸盐缓冲液抑制TaqDNA聚合酶的活性，因此忌用之。

97、什么是连接的？主要有哪儿种？

答:用于将两段DNA拼接起来的酶叫连接酶。分子克隆中最常用的连接酶是T,菌体DNA连接酶，还有一种

大肠杆菌DNA连接酶。

98、常用的核酸酶有哪些？各有什么活性？

答：

①BAL31核酸酶：3,外切核酸酶活性和内切核酸酶活性。

②&核酸酶：降解单链DNA或RNA,产生带5'磷酸的单核甘酸或寡核甘酸

③绿豆核酸酶：降解单链DNA,产生带5'磷酸的单核甘酸或寡核甘酸。

④核糖核酸酶A：RNA酶A是内切核糖核酸酶，可特异地攻击RNA上喀咤残基的T端，切割与相邻核甘酸

形成的磷酸二酯键。产生带啥呢3'磷酸的寡核甘酸或瞪吃3'磷酸。

⑤核糖核酸酶RNA酶*是内切核糖核酸酶，它特异地作用于鸟口票吟核甘酸3'磷酸并切割与相邻核昔

酸相连的磷酸二酯键。产物为鸟喋岭核昔3,磷酸或带鸟噤吟核甘3'磷酸的寡核甘酸。

⑥脱氧核糖核酸酶I：DNA酶I为一内切核酸酶。它优先从嚓脏核甘酸的位置水解双链或单链DNA,产物

为5'磷酸单核甘酸及寡核甘酸的混合物。

⑦外切核甘酸m：从双链DNA的3'羟基端逐一去除单核甘酸，结果是在双链DNA上产生长的单链区。

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⑧入噬菌体外切核酸酶：可催化从双链DNA中持续地逐一释放5'单核甘酸的反应。

99、影响琼脂糖凝胶DNA迁移速率的因素有哪些？

答：

①DNA的分子大小：DNA在凝胶中的迁移速率与其分子大小成反比。

②琼脂糖浓度：DNA电泳迁移率与凝胶浓度成反比。

③DNA的构象：分子量相同的超螺旋环状（I型）、带切口环状（H型）及线状（III型）DNA通过凝胶时速

度不一。

④所加电压：在低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比

⑤电场方向：通过电场方向周期性改变，可分辨极大的DNA分子。

⑥碱基组成与温度：4-30C之间影响不明显。

⑦嵌入染料的存在：漠化乙锭可使线状DNA的迁移率降低15%。

⑧电泳缓冲液的组成：电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。

100、从凝胶中回收DNA的常用方法有哪几种？

答：

①电泳到DEAE-纤维素膜上。

②电洗脱到透折袋中。

③利用低熔点琼脂糖凝胶。

101、聚丙烯酰胺凝胶与琼脂糖凝胶相比有哪些优点？

答：有3个主要优点：①分辨力很强，长度仅仅相关0.2%的DNA分子即可分开；②所能装载的DNA量远远

大于琼脂糖凝胶;③从聚丙烯酰胺凝胶中回收的DNA纯度很高，可适用于要求最高的实验（如鼠胚微注射）。

102、RNA提取和纯化过程中应怎样控制RNA酶的活性？

答：①实验程序中控制RNA酶活性：

A、玻璃制品、塑料制品和电泳槽：灭菌的一次性使用的塑料制品基本上无RNA酶，可以不经预处理

直接用于制备和贮存RNAo实验室用的普通玻璃器Hl和塑料制品经常有RNA酶污染，使用前必须于180℃

干烤8小时以上（玻璃器皿）或用氯仿冲洗（塑料制品）。另一种方法是用0.1%焦碳酸二乙酯（DEPC）的

水溶液浸泡用于制备RNA的烧杯、试管和其它用品。灌满DEPC的器皿在37℃放置2小时，然后用灭菌水

淋洗数次，并于100℃干烤15分钟，在15lbf/in2（1.034X105Pa）高压下灭菌15分钟。

用于RNA电泳的电泳槽应用去污剂洗净，再用水冲洗，用乙醇干燥，然后灌满3%的溶液；于室温

放置10分钟，然后用0.1%DEPC处理过的水彻底冲洗电泳槽。

最好能留出一些玻璃品皿、塑料制品和电泳槽作上特殊标记，存放在指定地点；为RNA实验专用。

B、研究人员的手是RNA前最主要的潜在污染源，因此在准备分离和分折RNA的材料和溶液时，以及

在涉及RNA的一切操作过程中，都应戴一次性手套，按触“脏的”物品后，手套就可能污染上RNA

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酶，因此进行RNA实验时应勤换手套。

C、溶液配制：用高压灭菌的水和RNA研究专用的化学试剂配制溶液，同干烤过的药匙称取试剂，将

溶液装入无RNA酶的玻璃器皿。可能的话，溶液均应用0.1%DEPC于37c至少处理12小时，然后

于100℃加热15分钟或在15lbf/in2（l.034X105Pa）的高压下蒸气灭菌15分钟。

②RNA酶的抑制剂：主要有下述3种。

A、RNA酶的蛋白质抑制剂：从胎盘分离的一种蛋白质可与多种RNA能紧密结合，形成非共价结合的

等摩尔复合物，使RNA酶失活。

B、氧钮核糖核昔复合物：它能与多种RNA酶结合并几乎能百分之百地抑制RNA的活性。

C、Macalod（硅藻土）：是・•种粘土，能吸附RNA的。

③破碎细胞和灭活RNA酶同步进行：用强烈变性剂如盐酸胭或硫氟酸服溶液能迅速溶解蛋白质，导致

细胞结构破碎，核蛋白由于其二级结构的破坏而从核酸上解离下来。

103、进行RNA分折的方法有哪些？

答：①Northern杂交（RNA印亦法）；②斑点和铁线杂交；③进行RNA的8核酸酣或核糖核酸前作图I；

④引物延伸法；⑤溶液杂交；⑥滤膜杂交。

104.Northern杂交主要有哪些步骤？

答：

①变性RNA琼脂糖凝胶电泳。

②分级分离的RNA转移至硝酸纤维素膜或尼龙膜。

③同放射性标记的探针对固定在膜上的RNA进行杂交。

105、构建CDNA文库常见的步骤有哪些？

答：①制备用于CDNA克隆的mRNA。②CDNA第一链的合成。③CDNA第二链的合成。④双链CDNA的分

子克隆（合成接头的加入和双链CDNA克隆入X噬菌体载体）。

106、从哺乳动物细胞中分离DNA的方法有哪些？

答：下面介绍从哺乳动物细胞中分离DNA的三种程序：

①利用蛋白酶K,SDS和酚，所获DNA的大小（100T50kb）适用于在噬菌体载体上的构建基因组DNA

文库；

②用蛋白酶K消化，用高浓度甲酰胺使DNA-蛋白质复合物解离，以及通过火棉胶透折袋透折除去残存

的蛋白酶K等步骤，这样得到的DNA分子量非常大，但浓度颇低。

③用盐酸服裂解细胞，所生成的DNA较小（约80Kb）,用于Southern杂交，效果极佳。

107、简述Southern杂交的步骤。

答：①琼脂糖凝胶电泳分离哺乳动物基因组DNA的限制酶切片段。

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②将DNA从琼脂糖凝胶转移到固相载体上。

③放射性标记的探针与固定化的核酸杂交。

108、将DNA或RNA从凝胶转移到大相支持体（硝酸纤维素滤膜或尼龙膜）的方法有哪几种？

答：

①毛细管转移：核酸片段由液流携带从凝胶转移并聚集于固相支持体表面。

②电转移：不适用于硝酸纤维素膜。适用于尼龙膜。

③真空转移：

109、杂交试验中常用降低背景的封闭剂有哪些？

答：

①Denhardt试剂：适用于Southern,Northern杂交

②BLOTTO：适用于Grusteiu-Hoyness杂交。

③肝素：适用于Southern杂交；原位杂交。

④经变性并被打断的鲤精DNA：适用于Southern,Northern杂交。

110、放射性标记核酸探针的方法有哪几种？

答：

①磷酸化法：由T4噬菌体多核甘酸激酶催化，将ATP的丫磷酸转移到DNA或RNA的5'羟基端；

②切口平移法：利用大肠杆菌DNA聚合醐I,把双链DNA未标记的核甘酸置换成a」2P标记的核甘酸。

③将克隆化DNA区段体外转录成高比活度的单链RNA。

11K筛选表达文库时所用的配体有哪几类？

答：筛选表达文库时，要利用一个能与目的蛋白特异结合的配体，这样的配体分成3类：

①已知可在体内与目的蛋白作用的蛋白质或小分子化合物；

②抗目的蛋白抗原表位的免疫球蛋白；

③可被蛋白质识别的小段DNA序列，比如真核基因转录调系统中的反式作用因子。

112、目前常用的DNA序列测定方法有哪几种？

答：酶法和化学