生物药物的一般生产工艺

关于生物药物的一般生产工艺第1页，课件共86页，创作于2023年2月掌握抗生素、氨基酸、蛋白质、核酸、维生素和辅酶、酶类、甾体、细胞生长调节因子与组织制剂的生产工艺、提取和精制工艺；掌握糖类药物分离纯化的手段和制备工艺相关技术；掌握脂类药物基本知识和其分离纯化的手段和制备工艺相关技术；掌握生物制品的分类、一般制造方法及典型生产工艺过程。熟悉抗生素类药物、氨基酸类药物、蛋白质类药物、核酸类药物、维生素及辅酶类药物酶类药物、甾体药物、细胞生长调节因子与组织制剂的通用生产工艺；熟悉氨基酸类药物常用提取方法；熟悉干扰素的生产工艺；熟悉维生素的提取工艺；熟悉生物制品的来源及应用。了解抗生素药物、胱氨酸、赖氨酸、维生素及辅酶类药物的结构和理化性质；了解核酸类药物的基本概念；了解酶类药物、甾体药物、细胞生长调节因子与组织制剂的生产步骤；了解几种糖类药物、脂类药物的制备；了解常用的生物制品的种类及生物制品的发展前景。知识要求第2页，课件共86页，创作于2023年2月熟练掌握抗生素、氨基酸、蛋白质、核酸、酶类、糖类、脂类、甾体激素、维生素和辅酶类、生物制品、细胞生长调节因子类药物的生产工艺，学会控制工艺要点，具备从事生物制药生产及相关工作的能力，能够理论联系实际，分析和解决实际问题的能力。学会根据药物的理化性质、药物来源、菌种，设计生产工艺。针对目标体系，熟练选择合适的分离体系对目标产品进行分离。针对目标体系，熟练选择合适的分离技术和制备工艺。能力要求第3页，课件共86页，创作于2023年2月一、抗生素工业生产及工艺抗生素生产方法：生物合成法、全化学合成法半合成法第一节抗生素类药物第4页，课件共86页，创作于2023年2月第5页，课件共86页，创作于2023年2月第6页，课件共86页，创作于2023年2月第7页，课件共86页，创作于2023年2月生物合成法也称为微生物发酵法。它将产生菌接种到培养基上，在一定的条件(培养基、温度、pH、通气、搅拌等)下培养、繁殖，产生抗生素。然后采用适宜的方法将抗生素从发酵液中分离出来。第8页，课件共86页，创作于2023年2月第9页，课件共86页，创作于2023年2月第10页，课件共86页，创作于2023年2月第11页，课件共86页，创作于2023年2月二、抗生素的生产工艺实例青霉素是β-内酰胺类抗生素的典型代表，它是指从青霉菌培养液中提制的分子中含有青霉烷、能破坏细菌的细胞壁并在细菌细胞的繁殖期起杀菌作用的一类抗生素。

第12页，课件共86页，创作于2023年2月1877年，法国微生物家巴斯德发现霉菌会抑制尿液中的炭疽杆菌的生长。1920年，比利时人安德烈·格拉提亚和莎拉·达斯在发表论文说感染了青霉的葡萄球菌培养基中，葡萄球菌的生长被抑制了。1928年夏弗莱明发现青霉素，1929年在《英国实验病理学杂志》上报道。1939年弗莱明将点青霉菌菌种提供给澳大利亚病理学家弗洛里和生物化学家钱恩。他们用冷冻干燥法提取了青霉素晶体。1940年弗洛里和钱恩证实了青霉素对链球菌、白喉杆菌等细菌感染的疗效。1942年美国制药企业开始大批量生产青霉素。1943年，制药公司已经发现了批量生产青霉素的方法。1944年，药物供应足够治疗第二次世界大战期间所有参战的盟军士兵。1945年，弗莱明、弗洛里和钱恩分享诺贝尔生理学或医学奖。1953年5月，中国第一批国产青霉素诞生。2001年年底，我国青霉素年产量已占世界年总产量的60％，居世界首位。第13页，课件共86页，创作于2023年2月第14页，课件共86页，创作于2023年2月青霉素作用机理：（1）作用于核糖核蛋白体的50S亚基，通过竞争细菌的粘肽合成酶，即青霉素结合蛋白（penicillinbindingproteins，PBPs），抑制细胞壁的粘肽合成，造成细菌细胞壁缺损，大量的水分涌进细菌体内，使细菌肿胀、破裂、死亡；（2）促发自溶酶活性，使细菌溶解。第15页，课件共86页，创作于2023年2月青霉素过敏！！！※青霉素最大的不良反应为过敏反应，发生率为0.7%～10%，最为严重的为过敏性休克，死亡率高达10%。青霉素本身并不是过敏原。青霉素分子在pH7.5水溶液中很快重新排列成青霉烯酸，进而分解为青霉噻唑酸。青霉噻唑酸可与人体组织内的γ-球蛋白和白蛋白结合成青霉噻唑蛋白，青霉噻唑蛋白即为引起青霉素过敏反应的主要致敏物质。第16页，课件共86页，创作于2023年2月第17页，课件共86页，创作于2023年2月青霉素的理化性质青霉素在水中的溶解度很小，易溶于有机溶剂如氯仿、笨、醋酸乙酯等。而其钠、钾盐则易溶于水和甲醇。青霉素在水中的pK值为2.7，在低pH（﹤4）条件下，霉素分子中的羧酸不解离，此时，青霉素易溶于有机溶剂而难溶于水；在高pH（﹥5）条件下，羧基发生酸式解离，此时青霉素易溶于水，难溶于有机溶剂。可利用此性质进行萃取与反萃取，精制青霉素。第18页，课件共86页，创作于2023年2月晶体熔点旋光性稳定性酸性4.羧基酸性强，可成盐5.水中不稳定，最适pH6～6.51.白色或黄色无定形2.不明显3.具旋光性水中pK值为2.7，pH﹤4易溶于有机溶剂，pH﹥5，易溶于水青霉素的理化性质第19页，课件共86页，创作于2023年2月2.青霉素的发酵工艺（1）菌种点青霉菌：生产能力很低，不能满足工业生产要求。产黄青霉菌：生产能力大为上升。MinnR-B和NRRL1951的生产能力分别为120U/mL和100U/mL，后者经诱变处理的变种，生产能力可达1000～1500U/mL。但该系菌株可分泌黄色素，影响了成品质量。变种51-20：不产色素变种51-20，其生产能力可达66000～70000U/mL。菌株WisQ176：全世界用于生产青霉素的高产菌株，其发酵生产水平已达85000U／mL以上。菌种保藏：真空冷冻干燥状态下保存分生孢子；也可用甘油或乳糖溶剂作悬浮剂，在-70℃冰箱或液氮中保存孢子悬浮液和营养菌丝体；还可用砂土管保藏。第20页，课件共86页，创作于2023年2月（2）发酵工艺流程冷冻干燥孢子琼脂斜面米孢子种子培养发酵培养过滤青霉素回收灭菌空气消泡剂补料碳氮前源源体米孢子综合利用图12-4青霉素发酵工艺的一般流程图孢子培养以生产丰富的孢子(斜面孢子和米孢子)为目的种子培养则以繁殖菌丝体(种子罐培养)为主要目的第21页，课件共86页，创作于2023年2月①生产孢子的制备将砂土孢子先在用甘油、葡萄糖、蛋白胨组成的培养基进行斜面培养，经传代活化。最适生长温度在25～26℃，培养6～8天，得单菌落，再传斜面，培养7d，得斜面孢子。再移植到优质小米或大米固体培养基上，25℃，相对湿度45%～50%,生长7d，制得小米孢子。孢子成熟后进行真空干燥，低温保存备用。第22页，课件共86页，创作于2023年2月②生产种子制备青霉素常采用三级发酵。一级种子发酵：米胞子进入发芽罐，培养基上的孢子萌发，形成菌丝。接种到以葡萄糖、蔗糖、乳糖、玉米浆、碳酸钙、玉米油、消泡剂等为培养基的一级种子罐内。发酵周期为40～50h，温度27±1℃。通无菌空气，空气流量1:3m3/(m3•min)，搅拌转速为300～350r/min。二级发酵罐：按10%接种量移种到培养基成分为玉米浆、葡萄糖、玉米油、消泡剂等的二级种子罐内。通风比为(1:(1～5)m3/(m3•min)，搅拌转速为250～280r/min，温度25±1℃；发酵周期为13～14h。第23页，课件共86页，创作于2023年2月③发酵生产二级种子达到要求后，可进入生产罐，培养基成分为花生饼粉(高温)、麸质粉、玉米浆、葡萄糖，尿素，硫酸铵，硫酸钠、硫代硫酸钠，磷酸二氢钠，苯乙酰胺及消泡剂，CaCO3等。接种量在20%，通气比控制在1:(0.8～1.2)m3/(m3·min)，搅拌转速为150～200r/min，罐压控制0.04～0.05MPa，于25～26℃下培养，发酵周期在200h左右。前60hpH为6.8～7.2，而后pH稳定在6.5左右；前60h温度为26℃，以后为24℃。第24页，课件共86页，创作于2023年2月④发酵工艺要点

基质浓度的影响

培养基

温度

pH值

溶氧菌丝生长速度与形态、浓度消泡补料分批操作法碳源：葡萄糖、乳糖；氮源：玉米浆变温控制法，前期25～26℃，后期22℃

通气比为1:0.8v/v/m氨水调节，前期5.7～6.3，中后期6.3～6.6

发酵稳定期，湿菌占15～20%，丝状菌干重3%，球状菌干重5%。中后期每天放一次，每次放掉总发酵液的10%前期，间歇搅拌且不多加油脂；中期可加油控制，必要时降低空气流量，但搅拌应充足；后期尽量少加消泡剂第25页，课件共86页，创作于2023年2月3.提炼工艺工程第26页，课件共86页，创作于2023年2月（2）提炼工艺过程和控制要点12345萃取：BA多次萃取发酵液的预处理：冷却过滤：板框压滤机，絮凝剂脱色：活性炭结晶：醋酸钾-丁醇

第27页，课件共86页，创作于2023年2月肖邦雪莱契诃夫鲁迅席勒林徽因梭罗林黛玉第28页，课件共86页，创作于2023年2月(二)链霉素第29页，课件共86页，创作于2023年2月(二)链霉素链霉素又称链霉素A，属氨基糖苷类抗生素，分子式为C21H39N7O12，由链霉胍、链霉糖和N-甲基-L-葡萄糖胺三个部分以苷键结合而成的糖苷。第30页，课件共86页，创作于2023年2月1.链霉素的理化性质硫酸链霉素为无臭或微臭的白色或类白色粉末，有引湿性。分子中有三个碱性基团，在中性溶液中以三价阳离子形式存在，可用离子交换法提取。在空气或日光中稳定。易溶于水，不溶于甲醇、氯仿和丙酮，硫酸盐难溶于甲醇。第31页，课件共86页，创作于2023年2月（1）菌种早期的链霉素菌种是灰色链霉菌(Streptomycesgriseus)，后来发现了比基尼链霉菌(S.bikiniensis)、灰肉链霉菌(S.griseocarneus)等也可生产链霉素。1.链霉素的发酵工艺第32页，课件共86页，创作于2023年2月（2）发酵工艺流程第33页，课件共86页，创作于2023年2月（3）发酵工艺要点发酵工艺要点2314斜面孢子培养摇瓶种子培养种子罐扩大培养发酵培养第34页，课件共86页，创作于2023年2月

①斜面孢子培养将保藏在低温(0～2℃)的砂土管中的菌种接种到斜面培养基上，接种后于27℃下培养6～7d，得到原始斜面，而后由原始斜面的丰满单菌落接种到子斜面上得到生产斜面，27℃下培养6～7d。经两次传代后，可纯化菌株。生产斜面菌落为白色丰满梅花或馒头型，背面有淡棕色色素。合格的孢子斜面保存在冰箱(0～4℃)内。培养基的成分：葡萄糖、蛋白胨、氯化钠和豌豆浸液等。第35页，课件共86页，创作于2023年2月②摇瓶种子培养生产斜面的菌落接种到摇瓶培养基中，得到摇瓶种子。摇瓶种子（母瓶）可以直接接种种子罐，也可以扩大培养，用所得子瓶接种。发酵单位、菌丝阶段、菌丝粘度或浓度、糖代谢、种子液色泽和无菌检查为评价摇瓶种子的重要指标，且冷藏时间不能超过7天。培养基的成分：黄豆饼粉、葡萄糖、硫酸铵、硫酸钙。第36页，课件共86页，创作于2023年2月③种子罐扩大培养种子罐可分为2～3级，用来扩大种子接种量。由于1级种子罐的接种量较小，因此培养液的体积有所限制。而对于2级种子罐，接种量为10%，到了最后，接种到发酵罐的接种量在20%左右。第37页，课件共86页，创作于2023年2月④发酵培养a.培养基发酵培养基的成分为葡萄糖、黄豆饼粉、硫酸胺、磷酸二氢钾、磷酸钙、玉米浆等。葡萄糖总量一般在10%左右，磷酸盐浓度为46.5～465mg/L，Fe2+浓度不能超过60μg/L。b.pH值菌丝生长的pH值为6.5～7.0，生物合成最适pH为6.8～7.3。c.温度灰色链霉菌发酵温度在28.5℃左右最适宜。d.溶氧灰色链霉素是一种高度好气菌，在黄豆粉培养基内，增加通气量能提高发酵单位。同时增加通气量也能升高pH值。e.补料放罐时控制葡萄糖的浓度低于1%，以利于后续提取。f.消泡在发酵过程中泡沫较多，需补入消泡剂。第38页，课件共86页，创作于2023年2月一次洗脱第39页，课件共86页，创作于2023年2月3.提炼精制工艺①发酵液的过滤与预处理工业上采用草酸调节发酵液的pH至2.8～3.2，同时蒸汽加热到70～75℃维持2min，使蛋白质凝固，提高过滤速度。草酸酸化还可除去Ca2+。酸化液过滤后用NaOH调pH到6.7～7.2可得到原滤液。原滤液链霉素浓度在5000U/ml左右。原滤液中Mg2+，可以加入三聚磷酸钠去除。②吸附与洗脱生产上主要使用羧酸树脂的钠型，提取链霉素后容易洗脱。流出液中的单位在100U/mL以下。国内生产一般应用弱酸110×3或101×4树脂，而在国外广泛使用一种大网络羧酸阳离子交换树脂AmberliteIRC-50。③精制洗脱液中含有较多的杂质，链霉素含量只有75%～90%。可以采用高交联度的氢型磺酸树脂，除去洗脱液和工业硫酸带入的金属离子和阳离子化的有机分子杂质。酸性精制液用羟型阴离子交换树脂中和酸，最后得到链霉素精制液。精制液以活性炭脱色，脱色后以Ca(OH)2调pH至5.5～6.0，过滤后，进行真空薄膜蒸发浓缩。所得浓缩液仍有色素、热原等杂质，需进行第二次脱色，改善成品色泽和稳定性。成品浓缩，无菌过滤后喷雾干燥可得成品。链霉素的总收率为72％左右。第40页，课件共86页，创作于2023年2月四环素是四环类抗生素的典型代表，分子含氢化并四苯母核由放线菌产生。四环素为抑菌性广谱抗生素，除革兰氏阳性、阴性细菌外，对立克次氏体、衣原体、支原体、螺旋体均有作用。抗菌机理是阻止细菌氨酰基-tRNA与核糖体相结合，抑制其蛋白质合成，但剂量大时对人的蛋白质合成亦有一定影响，易进入胎儿血液，孕妇忌用。本类药物可络合亚铁、钙、镁、铝等离子成为难溶性络合物，影响口服的吸收，勿与硫酸亚铁、氢氧化铝凝胶及牛乳等同服。（三）四环素第41页，课件共86页，创作于2023年2月1.四环素的理化性质四环素为黄色晶体，两性化合物，含有酸性的三羰基甲烷系统(pka=3.3)和酚二酮系统(pka=7.5)，碱性的二甲氨(pka=9.5)。能和各种酸、碱形成盐，临床上广泛应用的是它们的盐酸盐形式。等电点pH值为5.4。当pH=4.5～7.2时，四环素难溶于水；当pH值﹤4或﹥8时，可以得到高浓度的四环素水溶液。四环素不溶于与水不相互溶的的有机溶剂。四环素含6分子结晶水，水的含量达到19.6%。四环素在干燥条件下固体比较稳定，遇日光易变色，在酸性及碱性条件都不够稳定，易水解。第42页，课件共86页，创作于2023年2月2.四环素的发酵工艺过程（1）菌种最早的金霉素菌种是1948年由Duggar发现的金色链霉素(streptomycesaureofaciens)，发酵水平为165U/ml，以后发现在培养基中加入抑氯剂后，该菌能产生95%的四环素。第43页，课件共86页，创作于2023年2月第44页，课件共86页，创作于2023年2月（四）红霉素红霉素属大环内酯类抗生素。它是由红霉素内酯环、红霉糖和红霉糖胺三个亚单位构成的14元大环内酯。抗菌谱广，对革兰氏阳性菌作用很强，对部分革兰氏阴性菌（如淋球菌、脑膜炎双球菌等）也有效。临床上主要用于治疗呼吸道感染、皮肤与软组织感染、胃肠道感染等。其副作用较少，尤其适用于青霉素过敏者。第45页，课件共86页，创作于2023年2月1.红霉素的理化性质红霉素为白色或类白色的结晶性粉末，微有吸湿性，味苦，易溶于醇类、丙酮、氯仿、酯类，微溶于乙醚。它在水中溶解度低，且随温度升高而降低，工业上常利用此性质，加热红霉素溶液使其结晶。红霉素为碱性化合物，能和无机或有机酸形成在水中溶解度较大的盐类。红霉素在pH6～8范围内稳定；碱性条件下，红霉素内酯环容易破裂；酸性条件下，分子中的糖基易水解。第46页，课件共86页，创作于2023年2月2.红霉素的发酵生产工艺（1）生产菌种红霉素的产生菌是1952年Mc.Quire等在菲律宾群岛发现的红色霉菌（Streptomyceserythreus），红霉素是红色链霉菌在特定培养条件下的一种代谢产物。目前采用该株的变异株生产红霉素。红霉素链霉菌在合成琼脂培养基上生长的菌落是由淡黄色变为微带褐的红色，色素不渗透到培养基中，气生菌丝呈白色，孢子丝呈不紧密的螺旋状，约3～5圈，孢子呈球形。常用沙土管或冷冻管保存，以冷冻管保藏的种子质量更好。第47页，课件共86页，创作于2023年2月第48页，课件共86页，创作于2023年2月第49页，课件共86页，创作于2023年2月三级逆流萃取工艺流程第50页，课件共86页，创作于2023年2月三级错流萃取

料液经萃取后，所得萃取液多次与新鲜萃取剂接触，进行反复萃取操作。第51页，课件共86页，创作于2023年2月第二节氨基酸类药物第52页，课件共86页，创作于2023年2月氨基酸生产方法12354微生物转化法酶工程法蛋白质水解提取法化学合成法微生物直接发酵法第53页，课件共86页，创作于2023年2月第54页，课件共86页，创作于2023年2月氨基酸类药物的常用提取分离方法1234溶解度和等电点法特殊沉淀法离子交换法氨基酸的结晶与干燥第55页，课件共86页，创作于2023年2月三、氨基酸类药物生产实例（一）水解提取法生产胱氨酸胱氨酸英文名为Cystine，别名：双巯丙氨酸;3,3'-二硫代二丙氨酸。L-胱氨酸为含硫氨基酸，广泛存在于毛、发、骨、角中，可由蛋白质（如人发）水解、精制而得，或由半胱氨酸在碱性水溶液中氧化而成。在人发和猪毛中含量最高。人发含胱氨酸约为8%～10%，猪毛约为6%～8%。胱氨酸能促进细胞氧化还原功能，使肝脏功能旺盛，并能中和毒素、促进白细胞增生、阻止病原菌发育等作用。主要用于各种脱发症。也用于痢疾、伤寒、流感等急性传染病、气喘、神经痛、湿疹以及各种中毒疾患等。并有维持蛋白质构型作用。第56页，课件共86页，创作于2023年2月1.胱氨酸结构及理化性质胱氨酸是由两分子半胱氨酸脱氢氧化而成，含两个氨基、两个羧基和一个二硫键。纯品为白色六角形板状晶体或结晶粉末，无味。有三种异构体。熔点：左旋体258～261℃（分解），右旋体247～249℃（分解），消旋体260℃（分解）。pI为4.6，溶于水，不溶于乙醇等有机溶剂。易溶于酸、碱溶液中，在热碱液中易分解。第57页，课件共86页，创作于2023年2月第58页，课件共86页，创作于2023年2月（一）赖氨酸的生产工艺赖氨酸（lusine，Lys）为碱性必需氨基酸。由于谷物食品中的赖氨酸含量很低，且在加工过程中易被破坏而缺乏，故称为第一限制性氨基酸。赖氨酸广泛存在与各种蛋白质中，肉。蛋。乳等蛋白中含量较高（7～9%），鸡卵蛋白中高达13%。目前赖氨酸的生产多采用微生物直接发酵法。第59页，课件共86页，创作于2023年2月1.赖氨酸结构及理化性质赖氨酸化学名称为2,6-二氨基己二酸。赖氨酸含有2个氨基(-NH2)和1个羧基(-COOH)，是一种具有明显碱性的氨基羧酸（见图12-16）。按光学活性分,赖氨酸有L型、D型和DL型3种构型。只有L型才能被生物利用，故通常所说的赖氨酸均指L型。由于游离的赖氨酸易吸收空气中的CO2，一般制成赖氨酸盐酸盐。赖氨酸盐酸盐含氮15.34%，相对分子质量为182.65。纯品为白色单斜晶形粉末，无臭，味甜，比旋光度为+21°，pI值为9.14，熔点为263～264℃。易溶于水，在水中溶解度0℃时为53.6g/100ml，25℃时为89g/100ml，50℃时为111.5g/100ml。不溶于乙醇和于醚。第60页，课件共86页，创作于2023年2月第61页，课件共86页，创作于2023年2月第62页，课件共86页，创作于2023年2月ClicktoedittitlestyleClicktoaddTextClicktoaddTextClicktoaddText

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isaDesignDigitalContent&ContentsmalldevelopedbyGuildDesignInc.第79页，课件共86页，创作于2023年2月ClicktoedittitlestyleTextinhereTextinhereTextinhereThemeGalleryisaDesignDigitalContent&ContentsmalldevelopedbyGuildDesignInc.Addyourtextinhere第80页，课件共86页，创作于2023年2月ClicktoedittitlestyleText1Text2Text3Text4Text5AddyourtextinhereAddyourtextinhereAddyourtextinhereAddyourtextinhereAddyourtextinhereTextinhereTextinhereThemeGalleryisaDesignDigitalContent&ContentsmalldevelopedbyGuildDesignInc.ThemeGalleryisaDesignDigitalContent&Contents