测序的基本原理和应用

分析的基本原理和

Theworldleaderinserving主要内 O 无3’OH的 下一个dNTP的掺O3’

O3’ PCR反变DNA模 退引A延伸

酶荧光标记的（BigDye® 荧光标记 反应产ddNTP被加到正在合成的链上，由于它的3’-OH已被氧化，下一dNTP的5’-磷酸基团不能与之形成磷酸二酯键，使合成终止反应的延伸阶段，ddNTP在不同位置掺入产生度的新的 段 分析仪的基计算计算机分 数毛细毛细激光激发所有通电电泳方高高压电 序用点的大小代表DNA分子的颜色代表DNA所标记的颜色信 dNTPs/ddNTPs比例的重要反 不同 试剂盒用于不同 应 Proprietary&BigDye® 试剂盒荧提高酶活性的BigDyedNTPs/ddNTPs“原始的适于长片酶热稳定，适于模缓冲试剂盒配5xBigDyeSequencing BigDye® 试剂盒+再++++和+++De-再+

v1.1用于特殊的用快速电泳程序进行的短产靠 引物的序列判 BigDye® 注意：用v3.1可以得到更均一 峰，更好地区分混合碱基 BigDye® 举例 起FirstFirst如果想读 引物邻近的序列或 产物开始的50个碱基内区分出杂合，请选择BigDye®Terminatorv1.1kit 碱裂解法提取质粒，要用RNA酶消化和PEG沉CsCl商业化试剂盒(MagMaxTri-Reagent,Centri-避免超出纯化柱的DNA载可能需要额外的脱盐步 去除PCR反应液的残残留的引残留的dNTPs：以保持dNTPs/ddNTPs的最佳比盐成分：避免抑 酶活非特异PCR产物：避免扩增出同源性区ExoISAP消

稀 胶回收纯反 PCR反应的优化程PCR产物的质选择最佳的纯化方Proprietary&胶回收可用于任何质量的PCR产物纯-优势–去除非特异PCR产物和引物二聚"缺点"费重复性差，得率紫外照射可能会破坏DNA切下条带，然后用商品化试剂盒纯 柱纯异产物的纯化(如：引物二聚体)优势-简单、快-重复性缺点-不能去除100bp的非特异PCR产 用于特异PCR产物的纯E.,etal.1994,Nucl.Ac.Res.224354;HankeandWink,Biotech.17优势37℃，15min80℃，15min直接在PCR仪里进可用96孔板或384孔板进行高通量纯缺点 /当OD260＝1时，dsDNA浓度约为50μgOD260280比值：1.62.0(1.62.0：RNA残留OD230260比值：0.30.9(0.9：糖残留▪：专利性MolecularProbes荧Qubit®2.0Proprietary&PCR引 引物设计原长度：17-25碱Tm：55到65退火温度一般规>Ta(℃)=Tm–引物二聚发卡结二级结第二个结合位 引物重悬和定冻干粉：重悬在水或1mMTris（pH8.0）静置10min振荡后分用分光光度计利用引物特异的吸收系数检测引物浓度-20℃/-80 +4

母液保存(不要稀释，浓度越高越工作液保存(适当稀释，可以保存 PCR反应完成后存在什么 荧光标记

Tris+残留的 为什么要 PCR反应只消耗一小部分荧光标记的ddNTP(BigDye®残留的BigDye会 产物一起进入毛细管迁移，导致错误的碱基判峰 中 缩短毛细影响读缩短毛细结果优先进入毛细 Centri-Sep柱纯化 BigDye®XTerminator™纯化试剂盒简单，快速：三步法纯一个工作日可以完成所 流易于自动化或用移液器手工操纯化好 产物比较稳室温，48小4℃，10重跑样品时，无需重 反万一停电或电脑死机无需转 产“Chainofcustody”（每一步都可 塑料耗材消耗节省成 BigDye®XTerminator™AB专利 直接 反应管或板里面操样品的位置保持不无需其它耗去除残留的BigDye 室温，484°C10 Centri-SEP柱纯化加入800ul双蒸水，反复颠倒混匀，静置30min以上将离心柱和洗脱管一起离心（转速750g，2mins）去除间质中的液将 产物混合液直接转移至凝胶顶端的正上方中心位置将离心柱放入样品收集管（1.5mlEP管），并置于离心机转子中。保持先的离心柱方向，将离心柱和样品收集管同时离心（转速750g，2mins）纯化的样品将被收集 每管加入2L125mMEDTA(pH=8)，2L3MNaAc(pH=5.2，加到管底加入50L ，封严，震荡4次，室温放置153000xg4C离心30min，马上倒置96孔板，185 g离心1min加入70L ，3000xg4C离心15min，马上倒置96孔板，185x离心1min 重复洗涤1次或2 在室温挥发干，加入10LHi-Di甲酰胺，95C变性4min，迅速置冰上4min，上样电泳。 De重克隆 比 HLA甲基化分析(重亚硫酸 移植和骨髓配型前要进行供体 数据分数据分(Variant引物&重亚硫重亚硫循循

重亚硫

CpG→UG→TG5mCpG→5mCG→CG 在分子诊断中常见遗传病诊断 线粒体脑肌病：mtDNA3243,强直性肌营养不良：DMPK,神经性耳聋患者: 脊髓小脑型共济失调12型脊髓小脑型共济失调13 隐性脊髓小脑型共济失调8型： 突变检测发现DNA第3243位碱基序列存 在分子肿瘤 化治疗 启动子甲