甘薯脱毒技术“衡水赛”一等奖

作物生产技术专业/教学资源库甘薯脱毒技术靳改龙2019.2

甘薯脱毒技术作物生产技术专业/教学资源库作物生产技术专业/教学资源库甘薯生产技术(一）甘薯脱毒的重大意义“脱毒甘薯”指的是通过组培技术得到的植株，并经过严格的病毒检测、确认不带有某些病毒的甘薯及其在无蚜虫条件和无病源土壤繁育的后代。

甘薯脱毒技术是生物技术、病毒学技术和良种繁育技术有机结合的产物。经过脱毒一般可增产20％～30％，并对其外观、商品性还有所改善。因此，选用脱毒甘薯良种是取得甘薯高产的前提。由于甘薯本身无性繁殖的特点，甘薯品种一旦感染病毒后，病毒即在体内积累并通过薯块代代相传。病毒病不同于真菌和细菌病害，无法用杀菌剂和抗生素予以防治。虽然有些化学物质如人工合成的药剂以及某些提取的天然物质能抑制病毒增殖，但由于病毒不具有细胞结构，它的核酸入侵寄主后，利用寄主的代谢功能复制自己，因此，它和寄主的依存关系更为密切，虽然很多药剂能使病毒在体外失活，但施用于感染病毒的寄主以防治病毒病，亦对寄主具有严重的毒害作用。目前尚无有效的化学药剂防治病毒病，生产中也缺少高抗或免疫的甘薯品种。防治甘薯病毒病最有效的途径是培养、推广脱毒甘薯，从根本上克服病毒病对甘薯生产造成的危害，关键是要获得无病毒种苗。无病毒种苗是产生健康植株的前提和基础，而且由于无病毒种苗投放生产后，又会逐渐感染病毒，因此，只有保证能源源不断地为生产提供无病毒种苗，才能获得甘薯的持续高产稳产，充分发挥甘薯的生产潜力作物生产技术专业/教学资源库作物生产技术专业/教学资源库甘薯生产技术（二）甘薯脱毒的原理早在20世纪40年代，就有研究发现病毒在植物体内的分布是不均匀的，在染病的植株中，愈靠近茎尖病毒含量越低，顶端分生组织不带病毒或仅有少量病毒，随组织的老化，病毒含量增加。茎尖分生组织不带毒或很少带毒的可能原因是：在旺盛生长的分生组织细胞中，细胞的代谢活性很高，病毒的复制速度赶不上细胞的生长速度，另外，病毒在甘薯体内主要通过维管束组织和胞间连丝途径运转，而在茎尖分生组织中维管束尚未形成，胞间连丝的传导速度低于茎尖的快速生长，这速度之差就形成了茎尖无病毒区。甘薯脱毒苗的培养是利用甘薯茎尖导管组织不健全，病毒颗粒不易通过，甘薯茎尖不带或很少带病毒的原理,削离茎尖培养甘薯茎尖苗,对茎尖进行病毒检测,选出不带病毒的茎尖进行快速繁殖后在生产中推广应用利用以上所述茎尖存在无病毒区的现象，结合细胞全能性理论，在无菌条件下切取甘薯茎尖进行离体培养，即可得到不带病毒的植株。1960年NielSen用茎尖培养成功获得甘薯无病毒植株，此后，国内外许多研究者在这方面做了大量卓有成效的工作。研究表明，茎尖离体培养可有效地去除甘薯体内的病毒，目前甘薯茎尖分生组织脱毒技术已进入实用阶段。甘薯脱毒技术作物生产技术专业/教学资源库作物生产技术专业/教学资源库甘薯生产技术（三）甘薯茎尖培养脱毒技术1.甘薯脱毒的准备①器具条件除了高压灭菌锅、超净工作台、镊子、解剖针、长柄刀片等植株组织培养所需的一般工具外，由于须剥离只带1～2个叶原基的茎尖分生组织，大小只有0．1—0．3毫米，所以。还需要准备1台双目解剖镜。②培养基的配制甘薯茎尖分生组织培养目前常用的为MS培养基，由于在茎尖培养及试管微繁中需要经常配制培养基，为方便起见，一般将培养基组分先配成比所需浓度高的母液，配制培养基时只要按比例量取即可。一般将大量元素[MS(一)]配制成10倍溶液，Fe盐[MS(二)]、微量元素[MS(三)]及维生素[MS(四)]配成100倍溶液，分别存放。具体配方如下：

MS(一)：

NH4N031650×10=16500毫克

KNO31900×10=19000毫克

CaCl2·2H20440×10=4400毫克

M克S04·7H20370×10=3700毫克

KH2P04170×10=1700毫克称取以上药品，顺序溶解后定溶至1000毫升，即成MS(一)10倍母液，取量100毫/升。甘薯脱毒技术作物生产技术专业/教学资源库作物生产技术专业/教学资源库甘薯生产技术（三）甘薯茎尖培养脱毒技术MS(二)：

FeS04·7H2027．8×100=2780毫克

Na2一EDTA37．3×100=3730毫克按以上重量称取药品分别溶解后，置火上煮20～30分钟，以使Fe盐充分络合，呈黄亮溶液。冷却后定容至1000毫升，为100倍Fe盐母液，取量10毫升／升。

MS(三)：

H3B036．2×100=620毫克

MnS04·4H2022．3×100=2230毫克

CoCl2·6H200．025×100=2．5毫克

CuS04·5H200．025×100=2．5毫克

ZnS04·7H208．6×100=860毫克

Na2Mo04·2H200．25×100=25毫克

KI0．83×100=83毫克分别溶解后定容至1000毫升，取量10毫升／升。甘薯脱毒技术作物生产技术专业/教学资源库作物生产技术专业/教学资源库甘薯生产技术（三）甘薯茎尖培养脱毒技术Ms(四)：维生素B1O．1×100=10毫克维生素B60．5×100=50毫克烟酸0．5×100=50毫克甘氨酸2．0×100=200毫克溶解后定容至1000毫升，取量100毫升／升。肌醇可在配制培养基时加入，以免引起母液浑浊。母液配制好后，分别贴上标签，标明母液号、倍数、取量及配制日期，置于冰箱备用。生长调节物质也如上所述分别制成一定浓度的母液备用。配制培养基时，先称取6克／升琼脂粉加水溶解，并煮沸，以避免浓度不匀，然后按母液顺序依次量取规定的量后加入已溶解的琼脂中，最后加入30克／升蔗糖，定容至所配制体积。甘薯茎尖培养基pH值以5.8为宜，可用NaOH或HCl调节，然后用pH值试纸或酸度计进行pH值测试。培养基趁热分注后进行高压灭菌，一般保持7.84×104～10.78×104pa压力，20分钟既可达到灭菌效果，培养基也不受破坏。蒸馏水和器具消毒以30分钟为宜。甘薯脱毒技术作物生产技术专业/教学资源库作物生产技术专业/教学资源库甘薯生产技术（三）甘薯茎尖培养脱毒技术③外植体取材与消毒甘薯外植体取自苗床、大田植株或人工控制条件下薯块产生的幼芽均可，以生长健壮为宜，过弱不易剥取茎尖，茎尖接种后也不易成活。外植体进行消毒的原则是既要达到良好的消毒效果，又要将对外植体的毒害限制在最低限度，保持较高的成活率。具体方法如下：剪取2～3厘米芽段，去除较大叶片后，对顶芽进行表面消毒。先将芽段置于烧杯中，加入少量洗衣粉、洗涤剂振荡洗涤15分钟，然后用清水冲洗干净，置超净工作台备用。在超净工作台上，选用70％酒精浸泡30秒(酒精有很强的穿透力，切记时间不可过长)，然后用2％次氯酸钠溶液浸10分钟或0．1％氯化汞浸6分钟，其间要不断振荡，最后用无菌水冲洗3～4遍。次氯酸钠能分解产生具有杀菌作用的氯气而挥发掉，相对比较安全，副作用小；氯化汞较难去除，且毒力很强，易对外植体产生毒害，处理时间不宜过长。在实际操作中，由于茎尖分生组织有彼此重叠的叶原基严密保护，消毒方法可视外植体的来源灵活掌握，如人工控制条件下薯块产生的幼芽比从大田所取外植体杂菌污染机会要少，只要操作仔细，即可避免接种茎尖发生污染。甘薯脱毒技术作物生产技术专业/教学资源库作物生产技术专业/教学资源库甘薯生产技术(2)脱毒甘薯的生产脱毒甘薯的生产过程包括优良品种筛选、茎尖苗培育、病毒检测、优良茎尖苗株系评选、高级脱毒试管苗速繁、原原种、原种和良种种薯及种苗的繁殖等8个环节，每个环节都有严格的要求，最终目的是保证各级种薯的质量，充分发挥脱毒甘薯的增产潜力①选用优良品种甘薯优良品种很多，而且经过脱毒后都能不同程度地提高产量、改善外观品质。但甘薯品种都有一定的区域适应性和生产实用性，在进行甘薯脱毒时一定要根据本地区气候、土壤和栽培条件，选用适合本地区大面积栽培的高产优质品种或具有特殊用途的品种。②茎尖苗培育

在超净工作台上，把幼芽置于解剖镜下，一手用一把短镊子将其固定，另一手用解剖针剥离包被茎尖的叶片及叶原基，当半透明状的顶端分生组织充分暴露之后，用长柄手术刀片将带l～2个叶原基，长0．1～0．3毫米茎尖切下，接种在附加1～2毫克／升6一BA的MS培养基上离体培养，26～28℃下光培养，茎尖膨大变绿后转入无激素的MS培养基上培养成茎尖试管苗。待苗长至5～6片叶时移至营养钵内进行病毒检测。一般来讲，从剥茎尖到诱导出5～7片叶的茎尖苗至少要用60～90天。利用分生组织培养诱导甘薯茎尖苗是甘薯脱毒的技术关键。而且甘薯茎尖苗的培育需要有设备完善、仪器齐全的组织培养室，技术水平较高，投资较大，一般单位特别是基层单位不必要开展此项研究，可以从有条件的单位索取已经鉴定确认的脱毒试管苗或原原种进行繁育。甘薯脱毒技术作物生产技术专业/教学资源库作物生产技术专业/教学资源库甘薯生产技术③病毒检测茎尖分生组织培养得到的茎尖苗并不都是脱毒苗，只有部分苗不含病毒，是脱毒苗；茎尖苗必须经过严格的病毒检测确认不带病毒后，才是脱毒茎尖苗。茎尖苗的检测一般首先采取目测法淘汰弱苗和显症苗，然后再用血清学方法或分子生物学方法进行筛选。经血清学或分子生物学方法检测呈阴性的样品再进行指示植物嫁接检