DNA的基本分子生物学操作

DNA的基本分子生物学操作

（表达载体的构建）胥慧2009.9目前一页\总数四十页\编于十二点如何研究某个基因的功能?遗传学

突变体

基因缺失或下调过量表达体内/体外生化反应基因转入及表达!目前二页\总数四十页\编于十二点表达载体的构建btbk转化E.coli构建正确的质粒酶切鉴定转化粗糙脉孢菌Western检测表达BTBK的菌株目前三页\总数四十页\编于十二点表达载体构建流程零、策略的设计一、PCR扩增基因二、乙醇沉淀基因三、酶切基因及载体四、琼脂糖凝胶电泳回收基因及载体五、连接六、转化大肠杆菌七、质粒的小量提取八、PCR/酶切鉴定及测序九、质粒的大量提取目前四页\总数四十页\编于十二点/annotation/genome/neurospora/查找基因目前五页\总数四十页\编于十二点查找基因目前六页\总数四十页\编于十二点设计引物引物长度：18-22ntGC含量（DNAMANhybrid:50~60℃）DNAMAN检查：游离3’端>8bp以G/C结尾酶切位点的选择（巧用平端酶）保护碱基负义链引物注意反向考察是否移码EcoRV(buffer3)HpaI(4)ScaI(3)SmaI(4)SnaBI(4)StuI(214)目前七页\总数四十页\编于十二点一、PCR

（Phusion/Taq）5XHFbuffer:10μlNEBdNTPs:0.5μl

Phusion:0.4

μl

Primer1:0.5μl

Primer2:0.5μl

Template:1μl

ddH2O:37.1μl

98℃1min98℃10sec25X55℃30sec72℃1min72℃10min10℃∞Notes:1.Phusion酶的扩增效率为每分钟2~4kb.2.最后加酶！现用现取，取出冰浴。目前八页\总数四十页\编于十二点一、PCR10XPCRbuffer:5μlMgCl2:3μldNTPs:0.5μl

Taq:1μl

Primer1:0.5μl

Primer2:0.5μl

Template:1μl

ddH2O:38.5μl

94℃5min94℃30sec30X55℃30sec72℃2min72℃10min10℃∞请爱护PCR仪！反应完及时取出；散热5分钟；严禁过夜。目前九页\总数四十页\编于十二点问题篇P不出来：

从自己操作检查起；负义链引物是否忘记反向了；退火温度是否合适（考虑降温）；换模板；换Taq试；重设引物。大于5kb的基因考虑分两段。

量太少：

增大模板量；降温；多P几管。非特异条带：

若目的条带比非特异亮，大胆升温；若非特异比目的带大，严格控制延伸时间；胶回收目的带作模板再PCR。大小不对：

温度；模板；重设引物。目前十页\总数四十页\编于十二点二、乙醇沉淀DNA1.合并PCR产物，用TEbuffer将体系扩大至200μl，混匀。加入2~2.5V无水乙醇、1/10V醋酸钠(3M,pH5.2)，混匀。2.置于-80℃30min以上,或者，液氮速冻。3.4℃12000rpm离心15min，倒掉上清。4.70%乙醇洗沉淀，吸尽上清，烘干。5.以适量ddH2O溶解DNA。Notes:离心后迅速倒掉乙醇，切忌反复看到底有没有沉淀；可加完70%乙醇后再适当离心；烘干后保持EP管竖直向上；充分溶解DNA。目前十一页\总数四十页\编于十二点三、酶切做酶切前必须研究NEB产品目录！EcoRI目前十二页\总数四十页\编于十二点25度的50度的、60度的……三、酶切目前十三页\总数四十页\编于十二点三、酶切目前十四页\总数四十页\编于十二点酶切反应体系50μl体系5μl体系buffer1/2/3/4/U:5μl0.5μlDNA:xμlaμl

Enzyme:1.5~2μl0.3μl

ddH2O:补足三、酶切目前十五页\总数四十页\编于十二点反应的温度:

大多数酶的最适反应温度是37℃。25℃酶：ApaISmaI50℃酶：反应时间:（NEB快速酶切产品:5min）一般2h。若切末端的几个碱基，延长时间。研究NEB产品目录！三、酶切目前十六页\总数四十页\编于十二点三、酶切目前十七页\总数四十页\编于十二点双酶切不同反应温度的酶不可以作双酶切。若两者buffer相同，先切低温酶，再切高温酶；若buffer不同，用分步单酶切。参照NEB双酶切表选择buffer。考察两个酶在建议的buffer中的活性，一般认为活性75%及以上是可取的。不同buffer的酶用分步单酶切代替双酶切。即酶1切乙醇沉淀酶2切，再胶回收。分步酶切质粒时，若两个酶切位点是紧临的，则需考虑留出足够的保护碱基。三、酶切----TTGATGAATTCCTGCAGCCC--------AACTACTTAAGGACGTCGGG----EcoRIPstI目前十八页\总数四十页\编于十二点酶的星活力：

在非标准条件下切割非特异序列产生非特异片段。产生星活力的原因：甘油>5%；pH>8.0；乙醇残留…应对方法：严格按照NEB产品目录（buffer、适合的酶量、温度、时间1~8h）三、酶切目前十九页\总数四十页\编于十二点注意事项----爱惜、珍惜每一点酶！加酶时才去取酶，始终保持酶在冰上，加完酶迅速放回-20℃！酶必须深埋入-20℃的冰盒！（清理冰霜）旧酶用完后“涮”管子；保持同一种酶只有一管。新酶用前离心（甩）一下。盖子和标签一一对应，不要盖错。三、酶切目前二十页\总数四十页\编于十二点四、胶回收琼脂糖凝胶（Agarose）

Agarose浓度分离范围0.7%0.8~12kb1.0%0.5~10kb1.2%0.4~7kb缓冲液:TAE

贮液：50X工作：1X制0.8%胶：0.8gAgarose100ml1XTAE本实验室常用：0.8%(500bp~10kb)低浓度胶2%(<1.5kb)高浓度胶微波化胶降温加5μlEB目前二十一页\总数四十页\编于十二点电压：5V/cm本实验室：胶回收用90V；检测用120V。电泳方向：

DNA向正极泳动；EB向负极泳动。（跑过的胶的剩孔不宜直接再用）DNA染料EB：高度灵敏的荧光染色剂302nm366nm紫外可嵌入DNA碱基间的三环平面基团1EB/2.5个碱基加入：①直接加入胶中；②电泳后染色。配置：贮液10mg/ml；工作0.5ug/ml。5ulEB/100ml胶紫外透射反射仪：长波360nm回收用短波254nm四、胶回收目前二十二页\总数四十页\编于十二点Loadingbuffer（6X）配制6Xloadingbuffer：0.25%溴酚兰0.25%二甲苯青30%甘油or40%蔗糖6XTAEddH2O上样时5ulDNA+1ulloadingbuffer作用：①增加密度，使DNA沉降；②指示前沿在0.8%Agarose，溴酚兰约相当于0.5kb的DNA位置；二甲苯青约相当于5kb的DNA位置。四、胶回收目前二十三页\总数四十页\编于十二点Marker四、胶回收目前二十四页\总数四十页\编于十二点回收胶：配新胶（厚度适中）；换新电泳缓冲液。切胶时尽量少带空胶清洗刀片四、胶回收目前二十五页\总数四十页\编于十二点回收方法：液氮冻融法QIAGEN胶回收试剂盒Roche罗氏Transgene全氏Notes：1.溶胶后凉至室温，加1V的异丙醇有助于提高回收效率。2.溶胶液重复过柱2~3次。3.最后洗脱DNA之前稍微干燥一下柱子。4.洗脱DNA用35~50ulMillipore水，如有必要可重复洗。四、胶回收目前二十六页\总数四十页\编于十二点跑胶检测两个片段的浓度连接反应两个片段的比例：摩尔比vector:insert=1:3即:=1:3例如设需要vector为xul，跑胶估测浓度80ng/3ul，大小为5.2kb；需要insert为yul，跑胶估测浓度120ng/3ul，大小为1kb。则:=1:3

五、连接nginsertkbinsertngvectorkbvector80x

5.2120y

1目前二十七页\总数四十页\编于十二点连接酶E.coliDNAligaseT4噬菌体DNAligase√保存:-20℃冰上最多5~10min!!现用现取，用完立即放回！T4buffer：250mMTris·Cl(pH7.6)50mMMgCl25mMATP5mMDTT25%PEG8000五、连接目前二十八页\总数四十页\编于十二点反应体系T4buffer:0.5ulvector:xulinsert:yulT4ligase:0.4ul

25℃1h,then4℃1h.（T4连接酶4~25℃均可）T4连接酶效率很高，不需要怀疑。五、连接x+y=4.1ul目前二十九页\总数四十页\编于十二点六、转化受体菌：JM109超级感受态----转化效率高；生长快。70L感受态细胞中加入5LDNA，混匀，冰浴30min；42℃热激90秒，快速将管转移到冰上冷却3～5min；加入800L液体LB培养基，混匀，37℃摇床慢摇（100~110rpm）45min使细菌复苏，并表达质粒编码的抗生素抗性基因；3000rpm离心10min。移除750ul左右的上清，轻柔重悬细胞，将其涂布到含相应抗生素（Amp）的LB平板上。37℃倒置培养，10~16h后可出现菌落。（如检查氨苄青霉素抗性，用转化细胞铺平板时细菌密度应较低，培养时间不应超过20h，否则会出现对氨苄青霉素敏感的卫星菌落）。*若转化质粒，第4步不用离心，直接取10~50ul细胞涂板。目前三十页\总数四十页\编于十二点七、小提质粒离心收集菌体，尽量除尽培养基；加100L冰预冷的溶液Ⅰ，Vortex剧烈振荡；加200L新配制的溶液Ⅱ，加150L冰预冷的溶液Ⅲ，温和颠倒5次；12000rpm离心5min，转移上清到新管中；加2倍体积的无水乙醇沉淀DNA；12000rpm离心7min，倒掉上清；70%乙醇洗涤沉淀，吸尽上清，干燥；用30~50L含RNaseA的ddH2O溶解沉淀。（如果是过夜摇菌，则最后用50L。如果是白天摇菌，则用30L。）目前三十一页\总数四十页\编于十二点八、质粒的鉴定PCR：P插入片段酶切鉴定测序（Invitrogen公司。可测菌液/质粒/PCR产物）目前三十二页\总数四十页\编于十二点酶切鉴定：酶的选择载体和插入片段上都有的酶可判断出片段插入方向（靠近片段一侧）酶切产生的条带数为2~3条，不宜太多不宜有<500bp的小条带优选价格便宜的酶：EcoRV;EcoRI…鉴定用MBI的酶；5或10ul体系；0.3ul酶八、质粒的鉴定目前三十三页\总数四十页\编于十二点九、大提质粒50ml菌液分装到24个离心管，分两次离心收集菌体，尽量除尽培养基；加100L冰预冷的溶液Ⅰ，Vortex剧烈振荡；加200L新配制的溶液Ⅱ，加150L冰预冷的溶液Ⅲ，温和颠倒5次；12000rpm