HPLC分析方法的建立与开发

建立分析方法目前一页\总数一百二十九页\编于十三点色谱分离度与分离性能目前二页\总数一百二十九页\编于十三点HPLC分离的机理目前三页\总数一百二十九页\编于十三点色谱工作者关心的基本问题-色谱峰之间的分离度totRAmAUtimetRBR=分离度tRA=组分A的保留时间tRB=组分B的保留时间w=峰的基线宽度w1/2=半峰宽目前四页\总数一百二十九页\编于十三点分离度值目前五页\总数一百二十九页\编于十三点等梯度洗脱的基本分离度公式N:总的理论塔板数;柱效k:容量因子(保留因子),色谱峰的保留作用α：色谱峰的相对分离程度;选择性作用目前六页\总数一百二十九页\编于十三点影响分离度的因素目前七页\总数一百二十九页\编于十三点容量因子对分离度的影响目前八页\总数一百二十九页\编于十三点容量因子-----流动相组成的影响目前九页\总数一百二十九页\编于十三点选择性目前十页\总数一百二十九页\编于十三点影响选择性的参数降低增加较弱的溶剂较强的溶剂异丙醇/水甲醇/水乙腈/水C-2C-18容易超载不容易超载改变流动相组成改变固定相有机成分含量低的固定相有机成分含量高的固定相目前十一页\总数一百二十九页\编于十三点色谱柱温度对分离度的影响目前十二页\总数一百二十九页\编于十三点柱效目前十三页\总数一百二十九页\编于十三点计算柱效目前十四页\总数一百二十九页\编于十三点典型的流速值4.61-23.00.4-0.82.10.2-0.41.00.05-0.09柱内径mm(5um粒度)mL/minflowrate2=i.d.2i.d.12flowrate1目前十五页\总数一百二十九页\编于十三点柱外体积的影响10µL20µLTime,min.2.1x150mmF=0.2mL/min.样品体积连接管路的体积检测器体积检测器电子线路的时间常数目前十六页\总数一百二十九页\编于十三点所需分离度与柱长匹配目前十七页\总数一百二十九页\编于十三点峰对称性目前十八页\总数一百二十九页\编于十三点提高分离度增大k'增加选择性提高柱效目前十九页\总数一百二十九页\编于十三点分离度与k,n和的关系目前二十页\总数一百二十九页\编于十三点液相色谱流动相及固定相目前二十一页\总数一百二十九页\编于十三点流动相

与GC流动相不同，HPLC流动相为溶剂，它既有运载作用，又和固定相一起参予对组分的竞争，因此溶剂的选择对分离十分重要。1、

理想的溶剂应有下列特性1）化学稳定性好，与固定相不互溶、不发生反应2）必须和检测器相适应★使用UV检测器时，溶剂截止波长要小于测量波长★使用折光率检测器，溶剂的折光率要与待测物的折光率有较大差别目前二十二页\总数一百二十九页\编于十三点3）对待测物具一定极性和选择性4）高纯度。否则基线不稳或产生杂峰，同时可使截止波长增加；尽量避免使用有显著毒性的溶剂5）适宜的粘度★粘度过高，柱压增加★过低（例：戊烷、乙醚等），易产生气泡目前二十三页\总数一百二十九页\编于十三点2、溶剂的极性溶剂的极性强弱用溶剂强度参数表示，强度参数值越大，表示溶剂的洗脱能力越大。序号溶剂紫外波长极限（nm）序号溶剂紫外波长极限（nm）1异辛烷1979氯仿2452正己烷19010二氧六环2153甲基叔丁基醚21011丙酮3304苯27812乙醇2105二氯甲烷23313醋酸6正丙醇24014乙腈1907四氢呋喃21215甲醇2058乙酸乙酯25616水200目前二十四页\总数一百二十九页\编于十三点3、流动相的选择4、梯度洗脱特点：可以缩短总的色谱周期，提高分离效能，改善峰形，减少拖尾，可以增加灵敏度，会引起基线漂移目前二十五页\总数一百二十九页\编于十三点固定相化学键合固定相方法：通过化学反应将有机分子键合在载体表面形成柱填（约有3/4以上分离问题是在化学键合固定相上进行）特点：稳定、流失小、适于梯度淋洗分离机理：兼有吸附、分配两种分离模式。化学键合的表面覆盖度决定哪种机理起主要作用。对多数键合相来说，以分配机理为主。

目前二十六页\总数一百二十九页\编于十三点

载体主要是硅胶（表面有硅醇基）,特点为：♫可以制备成粒度分布窄的多种粒度♫机械强度好，可以填充成稳定、高效的填充床♫长期高压操作下不变形♫反压较低、柱寿命长♫较其它材料制成的柱有更高的柱效♫适用于小分子、大分子的分析和制备♫高pH值下会分解（pH＜8）目前二十七页\总数一百二十九页\编于十三点键合方法：（l）硅酯化（≡Si-O-R）键合固定相（2)硅氮型（=Si-N=）共价键合固定相（3）硅烷化（≡Si-O-Si-R）键合固定相使用键合固定相应注意的问题♫硅胶键合相的稳定性♫键合相色谱分离的重现性♫键合相色谱分离的选择性♫键合相色谱柱的再生

目前二十八页\总数一百二十九页\编于十三点化学键合相色谱法目前二十九页\总数一百二十九页\编于十三点正相色谱和反相色谱反相色谱的定义：在非极性的固定相上，用极性较大的液体作流动相进行物质分离分析的方法。即：反相色谱中键合固定相的极性要小于流动相的极性正相色谱的定义：在极性的固定相上，用极性较小的液体作流动相进行物质分离分析的方法。即：正相色谱中键合固定相的极性要大于流动相的极性目前三十页\总数一百二十九页\编于十三点正相色谱和反相色谱正相色谱和反相色谱的差别：正相色谱反相色谱固定相极性大小流动相极性小至中等中至大组分流出顺序极性小的组分先流出极性大的组分先流出流动相极性增大保留时间变小保留时间变大分离组分油溶性或水溶性的极性和强极性化合物非极性、极性或离子型化合物目前三十一页\总数一百二十九页\编于十三点正相色谱低极性流动相反相色谱高极性流动相中等极性流动相中等极性流动相时间时间时间时间待测物极性：A>B>C正、反相色谱中极性和保留时间的关系目前三十二页\总数一百二十九页\编于十三点正相键合相色谱法固定相：正相色谱中采用极性键合固定相，是把全多孔（或薄壳）微粒硅胶载体，经酸活化处理制成表面含有大量硅羟基的载体后，再和含有胺基、腈基、醚基的硅烷化试剂反应，生成表面具有胺基、腈基、醚基的极性固定相。

目前三十三页\总数一百二十九页\编于十三点流动相：在非极性或极性小的溶剂（如烃类）中加入适量的极性溶剂（如氯仿、醇、乙腈等），分离极性化合物。此时，组分的分配比k值随其极性的增加而增大，但随流动相极性的增加而降低。主要用于分离异构体、极性不同的化合物，特别适用于分离不同类型的化合物。目前三十四页\总数一百二十九页\编于十三点反相键合相色谱法

采用非极性键合固定相,是把全多孔(或薄壳)微粒硅胶载体,经酸活化处理后,和含有烷基链或苯基的硅烷化试剂反应,生成表面具有烷基(或苯基)的非极性固定相，如C18、C8目前三十五页\总数一百二十九页\编于十三点流动相：流动相是采用极性较强的溶剂，如甲醇、乙腈、水和无机盐的缓冲溶液等。它多用于分离多环芳烃等低极性化合物若采用含一定比例的甲醇或乙腈的水溶液作流动相，可用于分离极性化合物若采用水和无机盐的缓冲液为流动相，则可分离一些易离解的样品，如有机酸、有机碱、酚类等具有柱效高，能获得无拖尾色谱峰的优点目前三十六页\总数一百二十九页\编于十三点硅胶-烷基键合相中烷基链长对反相色谱分离的影响

时间，min固定相：C1固定相：C8固定相：C181-尿嘧啶；2-苯酚；3-乙酰苯；4-硝基苯；5-苯甲酸甲酯；6-甲苯可见：反相键合色谱中，键合相碳链越长，分离效果越好。目前三十七页\总数一百二十九页\编于十三点分析方法建立目前三十八页\总数一百二十九页\编于十三点分析时要了解的情况想办法得到各种信息向同行了解是否做过此类样品，或有否类似样品的分析方法查文献和方法，如CA,AA,AOAC,EPA---仪器制造商的文献充分了解自己的样品对色谱柱有足够的了解掌握分离机理，自己开发方法目前三十九页\总数一百二十九页\编于十三点分析时要了解的情况（续1）灵敏度的要求有多高?样品的本底是否很复杂?有多少组份要分析?对分析的精确度、准确度等有多高要求?是否因是日常检验，而要求方法容易使用?目前四十页\总数一百二十九页\编于十三点分离(制备)时要了解的情况要分离（即制备）的样品量有多大?要分离的组份在样品中的含量很高?还是微量?是否需要保持生物活性?对分离产物纯度的要求有多高?纯度或活性的鉴定如何完成?目前四十一页\总数一百二十九页\编于十三点什么化合物参数能用于分离?分子量不同/MW>2000凝胶渗透/凝胶过滤

离子化分子

离子对/离子交换

极性不同

吸附/反相色谱

同系物/苯系物

反相

中性、酸和碱的混合物 反相

生物分子

亲和/HIC/凝胶过滤/反相

立体异构体

吸附

手性化合物

手性色谱结构数据数据收集?固定相和流动相选择目前四十二页\总数一百二十九页\编于十三点一般的具体步骤先用一根短的色谱柱用相对较高的流速使用尽可能纯度高的标准品先用高强度的洗脱液调节k值改变保留值调节α值改变选择性调节柱长度改变柱效及分离速度记住∶

每次改变一个参数目前四十三页\总数一百二十九页\编于十三点使用文献方法注意点色谱柱填料的种类、品牌是否相同?注意文献方法的流动相是否损害色谱柱?如色谱填料品牌不同，需要调整流动相注意色谱柱的规格：内径、柱长需要调整流速、进样量注意梯度条件了解系统的滞后体积（梯度）目前四十四页\总数一百二十九页\编于十三点色谱方法转换如果没有与文献或要求相近的色谱柱转换进样量转换流速目前四十五页\总数一百二十九页\编于十三点常规样品分离的系统方法目前四十六页\总数一百二十九页\编于十三点总的指导原则改变可以明显改善选择性的条件避免会影响方法普适性的实际问题减少必要的实验次数，尽可能地利用计算机模拟选择适用于各种常规试样的实验，以便采用同样的方法建立未知样品（离子的或中性）的HPLC分析方法先做简单易行的实验（改变色谱柱、改变pH、使用复杂的混合溶剂等属于比较难做的条件）目前四十七页\总数一百二十九页\编于十三点反相HPLC分离的总体方案设计1、确定样品是属于常规的还是特殊的特殊样品包括：无机离子对映体生物分子合成的高分子碳水化合物异构体目前四十八页\总数一百二十九页\编于十三点2、选择分离条件，进行第一次分离分离变量最佳的初始选择柱填料C8

或C18柱结构15cm*4.6mm或25cm*4.6mm，5μm流速1.0ml/min（或2.0ml/min）流动相乙腈—水（中性样品）乙腈---缓冲液（离子型样品）（缓冲液为25--50mM磷酸缓冲液，pH2～3）对初始试验：5→100%B梯度温度常温进样量＜50μL（20μL）目前四十九页\总数一百二十九页\编于十三点选择流动相在反相色谱中常用水/乙腈pH的选择思路选低pH可以使柱硅羟基质子化并降低其色谱活性低pH与常见酸碱官能团的pKa值相差较远，组分在此条件下的tR受pH变化影响小

初期应避免使用三乙胺和离子对试剂等添加剂

准备标准样品

过滤样品

安装色谱柱

冲洗柱，平衡

平衡检测器

进样

分析结果!第一次

HPLC运行目前五十页\总数一百二十九页\编于十三点!第一次

HPLC运行选择逐步方法开发步骤用强洗脱液开始等梯度洗脱，此后每次运行降低洗脱液强度尝试运行梯度目前五十一页\总数一百二十九页\编于十三点!第一次

HPLC运行

无峰/响应

分离度差的峰第一次运行得到的结果可能:

检测方法不正确

浓度太稀提高进样浓度，或者在无色谱柱的条件下注射少量样品改变流动相优化系统得到了色谱峰-是 -否检查

HPLC系统目前五十二页\总数一百二十九页\编于十三点3、做初次运行并根据谱图将样品分类

0.5<k<20等度洗脱可行，超出此范围等度洗脱可行的样品建议用梯度洗脱的样品目前五十三页\总数一百二十九页\编于十三点反相保留太弱的样品改变pH、加入离子对试剂、改变柱子、改用正相色谱强保留样品用非水反相或正相条件复杂样品目前五十四页\总数一百二十九页\编于十三点4、对等度方法，用初始梯度运行来估计第二次等度运行的最佳B%5、评价第二次运行中峰的质量--柱效、峰宽、峰形★峰太宽或不对称：要改变初始的分离条件（柱子、pH、添加剂等）★运行情况良好：平行实验，保证柱平衡和可重复的保留时间目前五十五页\总数一百二十九页\编于十三点6、对等度方法，可以改变ACN%来改善峰间距和分离度★若有必要，ACN改为MeOH，并根据峰间距和分离度优化MeOH%★可以进一步混合ACN和MeOH成为三元溶剂系统，并优化7、若6方法中分离不充分，则可以改变分离的选择性和分离的附加条件目前五十六页\总数一百二十九页\编于十三点8、对梯度方法，用改变梯度变化速度和柱温来优化峰间距和分离度★结果满意，可以按等度分离方法优化溶剂类型★分离不充分，则可以改变分离的选择性和分离的附加条件9、对梯度方法，改变初始和最后的B%、梯度变化速度、梯度形状可以改善分离度或缩短运行时间10、对等度或梯度方法，改变一个柱条件（柱长、流速、填料尺寸）可以提高分离度或降低运行时间目前五十七页\总数一百二十九页\编于十三点等度分离方法目前五十八页\总数一百二十九页\编于十三点反相色谱的方法开发开发过程实例色谱条件∶色谱柱：C18，4.6mm×15cm流动相：乙腈/水，不同的溶剂强度，60/40、50/50、40/60，由强渐弱（或走梯度）流速：1ml/min样品：①对羟基苯甲酸甲酯(MethylParaben)②对羟基苯甲酸丙酯(PropylParaben)③对羟基苯甲酸丁酯(ButylParaben)目前五十九页\总数一百二十九页\编于十三点改变容量因子K(改变比例)①对羟基苯甲酸甲酯②对羟基苯甲酸丙酯③对羟基苯甲酸丁酯通过改变流动相比例改变选择性目前六十页\总数一百二十九页\编于十三点改变选择性∶α通过改变流动相组成改变选择性同样强度的不同溶剂目前六十一页\总数一百二十九页\编于十三点固定相优化：改变色谱柱0246810120246810121234567891012456789103C-18C-8Optimization目前六十二页\总数一百二十九页\编于十三点10种巴比妥药物的分离（等梯度）保留时间(min)3.14

相对吸光度4.555.746.447.117.7410.7611.7912.631巴比妥2阿洛巴比妥3阿普比妥4苯巴比妥5异丁比妥6环戊巴比妥7布他比妥8海索比妥9异戊巴比妥10甲苯比妥25%乙腈12456789101112313目前六十三页\总数一百二十九页\编于十三点优化流动相-困难的分离01020304050607080901000204060801000201040305060708090100乙腈/水甲醇/水四氢呋喃/水甲醇1467253四氢呋喃乙腈1.从甲醇/水开始，优化溶剂组成以使所有色谱峰在合理的

k范围流出.2.选择洗脱强度相等的乙腈/水混合流动相进行下一次分析.3.用四氢呋喃/水流动相重复分析4.按比例混合等强度流动相再进行进样分析

优化目前六十四页\总数一百二十九页\编于十三点三种流动相的比较25%乙腈35%甲醇21%异丙醇洗脱顺序

选择性目前六十五页\总数一百二十九页\编于十三点离子型化合物的分离方式使用离子交换柱∶离子交换法主要用于“强”阴、阳离子使用反相柱通过改变流动相的pH值，使样品成中性加入“对离子”，使样品呈中性目前六十六页\总数一百二十九页\编于十三点离子型化合物在反相色谱柱上不保留改变流动相的pH值，抑制样品离子的电离适用于弱酸性化合物的分离降低流动相的pH值，使样品降低离子化使用硅胶基质C18填料使用条件应在填料基质的范围内硅胶柱的pH在2-8内目前六十七页\总数一百二十九页\编于十三点如果： 一些酸在pH低于2时还保持离子化 一些碱在pH高于7时还保持离子化可以有以下的选择离子交换色谱使用聚合物反相柱，在pH高于7时用离子抑制法使用“离子对色谱法”目前六十八页\总数一百二十九页\编于十三点分离弱离子化化合物的初始实验条件水相缓冲液/乙腈可变(k=0.5～20)分离变量初始选择尺寸粒度键合相15(或25)x0.46cm5或3.5µmC18或

C8溶剂

A和

B（%B）温度体积质量40°C20µL<25µg色谱柱流动相样品量流速1-2mL/min添加剂需要时，25-50Mm三乙胺缓冲液25mM磷酸钾,pH£3目前六十九页\总数一百二十九页\编于十三点缓冲液缓冲液

pKa

缓冲范围

缓冲液

pKa

缓冲范围磷酸 甲酸 3.8 2.8～4.8

pK1 2.1 1.1～3.1 乙酸 4.8 3.8～5.8

pK2 7.2 6.2～8.2 Tris(三羟甲基氨基甲烷)

pK3 12.311.3～13.3 8.3 7.3～9.3柠檬酸 硼酸 9.2 8.2～9.3

pk1 3.1 2.1～4.1 吡咯10.59.5～11.5pK2 4.7 3.7～5.7氨 9.2 8.2～10.2pK3 5.4 4.4～6.4其他常用的流动相添加剂磷酸三氟乙酸(TFA)甲酸目前七十页\总数一百二十九页\编于十三点离子对色谱法在反相色谱流动相内加入“离子对”试剂与样品中可电离的组份形成“对离子”在反相色谱柱上分离离子型化合物离子对试剂的类型季铵盐、叔胺盐（正离子），适用于弱酸烷基磺酸盐、高氯酸盐（负离子），适用于弱碱烷基长度不同，形成对离子的能力不同目前七十一页\总数一百二十九页\编于十三点离子对反相HPLC分离阴离子流动相

A和B含有离子对试剂C和D是纯缓冲液目前七十二页\总数一百二十九页\编于十三点离子对色谱的应用

抗组胺及减充血剂药物的分析目前七十三页\总数一百二十九页\编于十三点离子对色谱分析水溶性维生素目前七十四页\总数一百二十九页\编于十三点优化离子对HPLC优化参数

流动相的

pH

离子对试剂浓度

离子对试剂选择

流动相组成目前七十五页\总数一百二十九页\编于十三点方法开发的其他因素流速对柱效的影响不同内径的色谱柱有自己的最佳流速样品的进样量(浓度)对柱效的影响样品的进样体积对柱效的影响溶剂粘度对柱效的影响 以上因素均影响分离度目前七十六页\总数一百二十九页\编于十三点梯度方法目前七十七页\总数一百二十九页\编于十三点梯度洗脱的特点优点单位时间的分离能力增加检测灵敏度提高缺点仪器设备要求高不适合某些检测方式(RI)柱需再生平衡定量分析的重复性较低？目前七十八页\总数一百二十九页\编于十三点梯度的洗脱方式目前七十九页\总数一百二十九页\编于十三点复杂样品的一般流出问题早流出峰的分离度差迟流出峰的峰宽增加而峰高降低.由于k范围宽，所以分析时间长.强保留组分造成柱污染.等梯度洗脱

-在洗脱样品的整个过程中，流动相的组成保持不变.目前八十页\总数一百二十九页\编于十三点一种解决方案----梯度洗脱优点

改善分离度

提高检测性能

能够分离复杂样品

缩短分析时间

降低由于强保留组分而使色谱柱性能变差的可能性梯度洗脱-在分离过程中改变流动相组成.梯度的其他应用

柱清洗

方法开发中的尝试运行

目前八十一页\总数一百二十九页\编于十三点梯度方法开发---优化溶剂梯度5%有机相100%有机相从尝试运行开始-一个平缓的梯度

流速

柱长

柱重新平衡时间需要确定的因数:

有机溶剂

初始组成

梯度时间

梯度陡度

梯度形状目前八十二页\总数一百二十九页\编于十三点选择梯度陡度010203040min.100%B100%B0%B0%BtG=40tG=20100%B100%B0%B0%BtG=10tG=5010陡平缓目前八十三页\总数一百二十九页\编于十三点HPLC测定17种氨基酸举例-AQC衍生流动相A：称取NaAc·3H2O19.04g(或无水NaAc11.48g)溶解于1000ml纯水中，用1：1的稀磷酸溶液调节PH到约5.2，加1mlEDTA－2Na溶液，精确加入三乙胺2.37ml或称取1.72g，边加边搅拌，用稀磷酸调节PH：紫外检测pH＝4.95；荧光检测PH＝5.02，用0.45μm滤膜过滤，备用。使用之前超声波脱气20分钟流动相B：乙腈/水＝3：2，再加0.1～0.25ml丙酮/1000ml,混匀。使用之前超声波脱气20分钟目前八十四页\总数一百二十九页\编于十三点HPLC测定17种氨基酸举例-AQC衍生HPLC条件流动相A：流动相B梯度表

steptime(min)Flow(ml/min)A%001.01001151.0932201.0853280.8724340.7675391.006421.007431.01008531.0100

检测波长：248nm(荧光检测EX=250nm;EM=395nm)柱温：37C进样量：10μl目前八十五页\总数一百二十九页\编于十三点17种标准氨基酸HPLC分析-UV检测目前八十六页\总数一百二十九页\编于十三点梯度平衡时间的影响（一）10分钟的梯度，6分钟的平衡时间色谱图不重复目前八十七页\总数一百二十九页\编于十三点梯度平衡时间的影响（二）平衡时间∶6分钟平衡时间∶7分钟平衡时间∶8分钟平衡时间∶9分钟＆平衡时间从6到7分钟，第一个峰的保留时间有明显的变化，说明6到7分钟的平衡时间不足＆8到9分钟变化不大因而大于这个时间时，平衡充足

目前八十八页\总数一百二十九页\编于十三点梯度陡时,使用短色谱柱(降低

Vm)常常能改善分离度4.6x50mm

1. GLY-TYR 2. VAL-TYR-VAL 3. [GLU]-ß蛋白质

AMYLOIDFRAGM1-16 4. [TYR8]血管舒缓激肽 5. MET-ENK 6. 亮氨酸脑菲肽 7. 血管紧张肽

II 8. KINETENSIN 9. 核糖核酸酶 10. INS(EQUINE)4.6x150mm12345678910min.k*=2.5k*=2.6k*=4.5k*=5.90161284C8,3.5µm梯度: 2-75%Bin30min.流动相: A=5:95,ACN:H2O0.1%TFA B=95:5,ACN:H2O0.085%TFA流速: 1mL/min.进样: 10µL,每种组分2.6µg温度: 35°CUV: 215nm目前八十九页\总数一百二十九页\编于十三点仪器对梯度性能的影响死体积=从梯度形成到柱头的体积提高起始浓度将缩短分离时间,但由于死体积和形成梯度前的等度步骤，将使分离更依赖于仪器—泵的滞后体积越小越好.死体积目前九十页\总数一百二十九页\编于十三点定性及定量方法目前九十一页\总数一百二十九页\编于十三点

保留值定性的主要方法

★直接与已知标准物对照★某一未知峰和已知标准物的保留值完全相同—可能是★改变色谱柱或流动相，保留时间仍完全相同—基本是定性方法目前九十二页\总数一百二十九页\编于十三点利用文献的数据进行对比和定性分析注意HPLC的柱填充技术的复杂性，定性受到限制目前九十三页\总数一百二十九页\编于十三点最简单的方法：标准添加法

前提：要有标准物

判断的标准：加入标准样后，使未知样色谱峰增高，改变色谱条件，未知峰仍能增高目前九十四页\总数一百二十九页\编于十三点PDA，光谱图比较、谱库检索确认色谱峰的纯度

-保证每个色谱峰下只有一个被测的组份

-检查是否有共流出的物质（杂质）干扰色谱峰纯度确认的方法

-用光电二极管矩阵检测器比较光谱图

-峰纯度鉴定，四波长比例目前九十五页\总数一百二十九页\编于十三点MS，质谱图解析、谱库检索目前九十六页\总数一百二十九页\编于十三点定量分析定量分析的具体内容确定样品的类型，主要成分/痕量成分使分析条件的分离度（R）大于：1.5色谱峰的定性，峰一致性测定检测限及定量限：确定灵敏度及线性范围用标样建立标准曲线检查方法的准确度及精确度用标样定期检查方法目前九十七页\总数一百二十九页\编于十三点（一）定量分析基础1.定量分析的基本公式定量分析的目的：

要确定样品中某一组分的准确含量，是一种相对的定量方法

定量分析的方法：

在某些限定条件下，检测器响应值（色谱峰的峰面积或峰高）---所测组分的数量或浓度成正比，目前九十八页\总数一百二十九页\编于十三点即：

式中：---组分i的质量

—组分i的浓度

—组分的校正因子（与检测器的性质和被测组分的性质有关）

—组分i的峰面积，

—组分i的峰高目前九十九页\总数一百二十九页\编于十三点2.定量校正因子的测定（1）绝对校正因子（fi)★

fi的物理意义:单位峰面积所代表的I组分的量是一个与i组分的物理化学性质和检测器的性质有关的常数★定量校正因子的计算公式为：

式中：Ai

、hi—i组分的峰面积、峰高

mi

、Ci–-i组分的质量、浓度目前一百页\总数一百二十九页\编于十三点（2）相对校正因子（校正因子）：式中：f--相对校正因子，简称为校正因子，无因次量

fi,fs—i物质、基准物质（s）的质量（或浓度)Ai(hi),As(hs)---物质、基准物质的峰面积（或峰高）目前一百零一页\总数一百二十九页\编于十三点质量校正因子(fm)

定义：当物质量用质量来表示时的校正因子称为质量校正因子(fm),表示单位峰面积所代表的组分质量，质量一般用g或mg表示.

式中：mi,ms-被测物质、基准物质的质量

Ai,As-被测物质、基准物质的峰面积

目前一百零二页\总数一百二十九页\编于十三点（3）校正因子的实验测量方法

★样品的准备：测定校正因子时，要精密称定适量被测组分对照品和基准物质，配制成已知准确浓度的样品。

★样品的测定：在已确定的色谱条件下，量取样品进样，从谱图上获得准确的峰面积

★计算：根据相对校正因子的计算公式可以算出质量校正因子目前一百零三页\总数一百二十九页\编于十三点（二）定量方法1.归一化法

★定义：把所有出峰的组分含量之和按100%计的定量方法称为归一化法，是一种相对定量方法。★前提：样品中的所有组分都能流出色谱柱，而且在检测器上所有的组分都能产生信号。计算方法：

式中：Ai—组分i的峰面积

fi—组分i的质量校正因子法。目前一百零四页\总数一百二十九页\编于十三点★优点：简便、准确★缺点：校正因子的测定比较麻烦★注意：

▼主要用于GC的定量测定，当fi相近时，可直接用峰面积归一化法。▼由于检测技术的影响,HPLC中很少使用归一化目前一百零五页\总数一百二十九页\编于十三点2、外标法

是色谱定量分析中比较常用的一种方法，是绝对定量方法。目前一百零六页\总数一百二十九页\编于十三点计算方法：用浓度～峰面积（峰高）绘制标准工作曲线，其斜率即为绝对校正因子要求：回归线性方程

计算相关系数目前一百零七页\总数一百二十九页\编于十三点用单点进行计算：

依据：色谱的定量基础目前一百零八页\总数一百二十九页\编于十三点特点：★简便、快速、适合于大量样品的分析★无需各组份都被检出、洗脱★需要标样★标样及样品测定的条件要一致★进样体积要准确★对样品前处理过程中待测组分的变化无法补偿。

目前一百零九页\总数一百二十九页\编于十三点3.内标法

待测组分(i)的含量mi为：式中：Ai(hi)、As(hs)—待测组分i和内标物s的峰面积（峰高）

fi、fs—待测组分i对照品和内标物s的绝对校正因子

f—相对校正因子，由待测组分i的对照品和内标物s测定目前一百一十页\总数一百二十九页\编于十三点实际色谱图目前一百一十一页\总数一百二十九页\编于十三点关键：选择合适的内标物内标物的选择原则：A、内标物必须是原样品中不存在的物质，其性质尽量与待测组分相近(同系物、异构体)B、内标物不能和被测组分起化学反应，要能完全溶于被测样品中；C、内标物的峰尽可能接近待测组分的峰，或位于几个待测组分的中间，但必须和样品中的所有峰完全分离；D、内标物的加入量应和待测组分相近。目前一百一十二页\总数一百二十九页\编于十三点内标法的特点：

★进样量或色谱条件有微小变化时对定量结果影响不大

★可部分补偿待测组分在样品前处理时的损失

★若加入几种内标物，还可提高定量分析的精度。

★内标物的选择比较困难，同时内标物称量要求准确，操作麻烦。目前一百一十三页\总数一百二十九页\编于十三点4.标准加入法

标准加入法

★是一种特殊的内标法，★把待测组分的纯物质作为内标物加入到待测样品中★在相同的色谱条件下，测定加入待测组分纯物质前、后待测组分的峰面积（或峰高）★计算出待测组分在样品中的含量。目前一百一十四页\总数一百二十九页\编于十三点具体做法：第一步：在确定的色谱条件下，测定样品中待测组分(i)的峰面积或峰高，Ai(hi);第二步：在第一步所用样品中准确加入已知量为△mi的待测组分(i)，同样条件下测出峰面积或峰高，Ai’(hi’)；第三步：根据定量基本公式mi=fi×Ai(hi)计算目前一百一十五页\总数一百二十九页\编于十三点

mi=fi×Ai(hi)（前）

mi+△mi=fi’×Ai’(hi’)（后）

mi—原样品中待测组分(i)的量目前一百一十六页\总数一百二十九页\编于十三点标准加入法的特点①不需另外的标准物质做内标，仅需有待测组分的纯物质②进样量的准确性影响不大，操作简单③若在样品前处理之前就加入已知准确量的待测组分，则可完全补偿待测组分在前处理过程中的损失④要求加入待测组分前后两次色谱测定的色谱条件完全相同，才能保证两次测定时的校正因子完全相等