上海市临检中心 PCR技术人员上岗培训班课件 分子诊断质控品

分子诊断质控品的特性、选择和应用上海市临床检验中心王雪亮1涉及疾病种类2分子诊断实验室检测现状GeneReviews：截止2013年05月，已发现3007种基因疾病，其中2776种已经进入临床检测，231种仍在研究阶段，目前全球已有618个有资质的实验室在进行相关检测工作3临床实验室如何来保证检测结果的准确可靠？4专家指出采用已知弱阳性和阴性质控品进行室内质量控制是保证检测质量的关键环节之一，其监控的是实验室测定的最重要的性能指标，即重复性，并决定了当批实验测定是否有效，报告能否发出，是对实验室测定的即时性评价。李金明等，涉及基因扩增的个体化医学检测质量保证的重要性,2012,

35(11),963-9665质

控

品定义：用于体外诊断的质量控制物质，是一种旨在用于医学检测系统中使用的物质、材料等。目的：是评价或验证测量精密度或由于试剂或分析仪器的变化导致的分析偏差等。用途：用于室内质量控制、室间质量评价等。6质控品的种类•

根据有无测定值可分为定值质控品和非定值质控品。•

根据质控品的物理性状不同分为冻干质控品、液体质控品和固体质控品。7正确选用质控品（基本要素）•

基质效应小质控结果能真实反映性能提高不同系统间质控结果可比性•

稳定性好，有效期长质控参数可长期使用避免由于质控品问题导致的假阴性•

监测反应全过程8正确选用质控品（扩展要素）•

液体质控品消除复溶过程可能引入的误差，减少瓶间差•

已知靶值或预期结果定量测定：阳性（高、低浓度）、阴性定性测定：阳性（接近测定下限）、阴性•

价格便宜•

生物安全性9常用质控品类型•

临床样本•

细胞系•

人工制备样本9

基因组DNA9

质粒9

体外转录RNA9

假病毒颗粒10临

床

样

本11临

床

样

本HCV临床样本作为质控品邓演超等，国际检验医学杂志,2013,34(3):271-273组织样本作为分子病理质控品DequekerEMet

al,JMolDiagn,2016,18(2):205-14.12临

床

样

本优点：缺点：•

真实样本•来源有限•

评价整个分析过程

••

包含所需基因序列

•最优样本生物传染性可能存在异质性13临床样本制备质控品注意事项•

制备方法应规范，制定相关的SOP文件•

应经过质量检验，保证与预期结果相符。14细

胞

系MeissnerJD,JGen

Virol.

1999Jul;80(Pt7):1725-33.NAMALWA细胞用于EBV检测CYP2C19不同基因型王雪亮等,检验医学,

2015,30(11):

1078-1082LinGetal,PLoS

One,2015,10(7):e0134174.16细

胞

系缺点：优点：•

细胞株有限•

模拟真实样本，稳定性好•

评价整个分析过程•

生物安全性实用样本•

易于制备，成本低17人工合成样本——基因组DNA•

经验证的临床样本•

已知基因突变的细胞系1819人工合成样本——基因组DNA优点：缺点：•

有已知的突变位点

•非“真实”样本•

样本均一•

可再生••不能监测提取过程可能发生基因重排或丢失20人工合成样本——质粒21Eklund

C,etal,2012,J.Clin.

Microbiol,50:2289–2298.vander,

etal,2008,Pharmacogenomics,9:1261–6.人工合成样本——质粒优点：缺点：•

明确的基因序列•非“真实”样本•

易于生产，价格便宜•

不能监测提取过程•

无感染性•

稳定性好24人工合成样本——体外转录RNA25ChangMetal,JClinVirol.2012,55(2):128-33.人工合成样本——体外转录RNA优点：缺点：•

明确的基因序列•

稳定性差•

具有再生性•

无感染性•

不能监测提取过程27人工合成样本——假病毒颗粒Pasloske

BL

etal.,J

ClinMicrobiol.1998Dec;36(12):3590-4.人工合成样本——假病毒颗粒优点：缺点：•

明确的基因序列•

监测反应全过程•

生物安全性•

专利保护，价格昂贵•

表面结构不同，不能充分模拟真实病毒•

稳定性好目前现状？•

分子诊断项目快速增长•

新的技术发展（如NGS、数字PCR等）引入新的检测项目但是……对于绝大多数分子诊断项目，现在还不能提供阳性质控品（经过确认的更是少之又少！）30例如：囊胞性纤维症(CF)基因检测•

信息收集自35个美国临床检测实验室„所有临床实验室开展至少美国医学遗传学与基因组学学院（ACMG）推荐的23个CF等位基因„所有临床实验室鉴定102个不同的CF等位基因¾

仅有42个等位基因有相应的细胞系60个等位基因还没有可用的细胞！31专家指出尽管少部分分子检测项目已有质控物质，但是大部分的分子检测项目还是缺乏有效的质控物质。其次，现在的多元质控物质商品的开发也不够成熟。实验室更愿使用免费的患者标本或者根本不进行质量控制，只有罕见突变才勉强花钱购买质控品。王治国等，分子诊断质量控制面临的问题，2012，6(30)，466-467032官方机构-WHO/官方机构-GeT-RM官

方

机

构——其他¾American

Type

Culture

Collection/¾Coriell

Cell

Repositories/¾European

Collection

ofCell

Cultures.uk/¾GermanCollectionofMicroorganismsandCellCultureshttps://www.dsmz.de/¾Japanese

Collection

of

Research

Bioresourceshttp://cellbank.nibiohn.go.jp/english/¾Riken

Bioresource

Centerhttp://en.brc.riken.jp/35商业化公司¾

Acrometrix¾

QiagenMarseille/cn//¾

InVivoScribe¾

AdvancedBiotechnologies//¾

LGC

Standards¾

Diagnostic

Hybrids/epages/¾

Maine

Molecular

Quality

Controls¾

Zeptometrix//¾

Molecular

Controls¾

SeracareLifeSciences//default.aspx¾

Asuragen¾

Hologic

(Third

Wave

Technologies)//en/36质控品的使用•

已知阳性质控•

已知阴性质控•

空白（无模板）37阳性质控品•

定性检测9

接近方法测定下限浓度•

定量检测9

测定线性范围内的高、低浓度38阴性质控品•

监测实验室以前扩增产物的污染•

实验操作所致样本间的交叉污染•

试剂污染39空白管质控•

监测扩增试剂是否发生污染，具有较强的污染鉴别性•

监测反应液加样区及加样过程是否发生污染•

鉴别实验室是否发生污染40质控品使用的注意事项•

均匀分散于临床标本中，与临床标本同时处理•

扩增时不应将质控品放于固定孔中，放置位置应顺延以便监测每孔的扩增效率•

质控品虽经灭活处理，但仍具有潜在的传染性，仍应按传染性样本对待，注意防护措施•

注意质控品最佳保存条件，使用完毕后应及时放回，如发生下述情况严禁使用9

已过有效期9

样本管已发生泄漏9

样本管标记无法识别41失控分析42失控分析•

实验操作人员在检测样本时，如发现质控检测数据不符合质控规则，应在室内质控记录单上简述失控原因。•

失控的原因主要包括：操作失误、质控品失效、仪器维护不良等。43失控分析•

操作失误——主要是人为因素9

加样问题（漏加、错加等）9

试剂及样本识别9

误读误判9

其他操作问题（如：离心条件、操作不标准等）44失控分析•

质控品问题9质控品过期9保存不当，如冷冻样本冷藏保存，造成核酸降解9操作或意外污染：手工加样过程中交叉污染或加错样。45失控分析•

仪器设备等：9

PCR仪、离心机、加样器、恒温设备等应建立技术档案，应定期进行校准维护9开机检查，查看前一工作日实验检测报告及维护记录9常用耗材：吸头、离心管等46失控后处理•

重新测定同一质控品，应确认以下情况：9质控品是否在有效期内9检测试剂是否有问题9仪器、设备、耗材的应用情况是否出现异常查明是否有人为误差，另外还可以查出偶然误差，即重测的结果在允许范围内（在控）。如果重测的结果不在允许范围内，则可以进行下一步操作。47失控后处理•

新开一瓶质控品，重新测定失控项目•

主要目的：如果结果正常，说明原来质控品可能保存条件不当，发生核酸降解。如果仍然不在允许范围，则进行下一步。48失控后处理•

维护仪器，重测失控项目，应确认以下问题9怀疑试剂问题9仪器存在不稳定情况（以往或近期）主要目的：检查仪器状态，运行条件是否被更改。检查试剂，此时可更换试剂以查明原因。如结果仍不在允许范围，则进行下一步。49失控后处理•

确认正确应用以上步骤都未能得到在控结果，那就有可能是仪器的潜在问题或试剂的特殊原因，应上报质量主管、主任。•

对多次的质控失败查找原因，确认消除后才能开展正常检测工作。50阴性样本做出阳性结果？主要考虑——污染问题：•

如实验室以前扩增产物污染、样本间交叉污染、试剂污染、试验耗材、操作污染等•

科研工作中导致的质粒污染51阳性样本检测为阴性结果？主要考虑：•

试剂问题：Taq酶和/或逆转录酶失活、探针纯度标记效率、核酸提取试剂效率等•

质控品：核酸降解•

人为因素：核酸提取中随机误差、漏加样本、识别错误、判读错误•

仪器问题：如扩增仪孔间温度不均一性、孔内温度与所示温度不一致性等52弱阳性样本检测为阴性结果？•

表明目前实验室的检测精确度低，导致未检出弱阳性样本，需关注以下问题：9

试剂因素：可以考虑更换新一瓶试剂进行验证，确认此因素后，应启用新试剂9

质控品因素