南宁无创产前检测(NIPT)会议课件 安诺优达NIPT实验流程与技术细节介绍-薛月寒

NIPT实验流程与技术细节薛月寒yuehanxue@2017/12/09NIPT项目实验流程样本接收样本处理结果出具数据分析上机测序文库质控NIPT样本处理目录血浆分离实验流程与关键质控点12cfDNA提取实验流程与关键质控点3

文库构建实验流程与关键质控点血浆分离原理根据血液中红细胞与白细胞等沉降速度不同，利用高速离心进行血浆分离。血浆分离实验前检查离心前采血管外观检查唯一性样本编号有无破损、管盖松动情况。血浆分离实验流程唯一性样本编号4℃，1600xg

15min4℃，16000xg

10min4管，600uL/管2.0mL收集管血浆分离实验流程-低速离心低速离心1.先配平，后离心。2.先核对再操作：采血管样本编号与分装EP管样本编号是否一致。3.全程使用机打条码，无手写过程。4.动作轻柔，避免吸到白膜层和红细胞。5.

分离血浆需要在生物安全柜内进行。血浆分离实验流程-高速离心高速离心血浆分离异常处理√

√溶血正常、微溶血样本正常检测重度溶血样本重抽血处理血浆分离异常处理脂血凝血血浆分离关键点小结1.

先检查，再操作。2.

先配平，再离心。3.

先核对，再分装。4.

动作轻柔，避免吸到白膜层和红细胞。5.

分离血浆需要在生物安全柜内进行。cfDNA提取核酸提取试剂规格：96反应/盒cfDNA提取原理裂解吸附清洗洗脱DNA裂解

在血浆中加入裂解液和磁珠悬浮液，裂解液将核酸与蛋白质、多糖、脂肪等生物大分子物质分开。吸附

表面带有特定活性基团的磁珠特异性的吸附血浆中游离DNA分子。清洗

通过磁力架对吸附DNA的磁珠进行富集，利用清洗液清洗杂质。洗脱

最后使用洗脱液将DNA分子从磁珠上解吸附，从而达到分离和提取DNA的目的。cfDNA提取实验流程提取MIXBST1MKW1MW2裂解200uL单cfDNA提取实验流程1例阳性质控品/批次1例阴性质控品/批次1例空白水对照/批次提取时加入样本编号的一一对应操作人员记录仪器、试剂批号记录cfDNA提取实验流程磁珠过于干燥，DNA得率降低洗脱时间控制乙醇残留较多，抑制后续酶反应晾干前晾干后cfDNA提取关键点小结1.

样本编号一一核对。2.

加入阴阳性质控品和空白对照。3.

仪器、试剂、人员操作记录完善。4.

DNA洗脱时间控制。文库构建原理与flow

cell上P5相同样本唯一识别序列P7'P5'与flow

cell上P7相同DNA片段两端连接所需的接头，用于上机测序文库构建原理末端修复磁珠纯化加“A”加接头+磁珠纯化磁珠纯化标签引物共引物PCR反应通量：4-5h

≥48例/人磁珠纯化磁珠室温平衡（30min）磁珠纯化磁珠吸附去除废液洗涤洗脱于磁力架吸将待纯化产物加入磁珠中，吹打混匀附后吸净残液。吸取残液时充分吸净，避免影响后续反应将洗脱液与磁珠充分吸打混匀，静置75%乙醇洗涤，吸净残液，晾干使用前充分震混使用前平衡至室温涡旋震荡磁珠至均匀悬浮磁珠纯化磁珠室温平衡（30min）磁珠纯化磁珠吸附去除废液洗涤洗脱于磁力架吸将待纯化产物加入磁珠中，吹打混匀附后吸净残液。吸取残液时充分吸净，避免影响后续反应将洗脱液与磁珠充分吸打混匀，静置75%乙醇洗涤，吸净残液，晾干使用前充分震混转板复核磁珠纯化磁珠室温平衡（30min）磁珠纯化磁珠吸附去除废液洗涤洗脱于磁力架吸将待纯化产物加入磁珠中，吹打混匀附后吸净残液。吸取残液时充分吸净，避免影响后续反应将洗脱液与磁珠充分吸打混匀，静置75%乙醇洗涤，吸净残液，晾干使用前充分震混纯化过程磁珠状态磁珠在磁力架上干燥，防止静电造成磁珠飞出磁珠过于干燥，DNA洗脱得率降低乙醇残留较多，抑制后续酶反应NIPT实验流程－文库构建不扩增正常扩增文库构建用到的试剂酶反应用试剂盒纯化用试剂盒规格：96人份/盒规格：192人份/盒文库构建用到的仪器温

浴仪（酶反应）磁力架（纯化）8道移液器操作，1次操作同时处理8例样本文库构建关键点小结1.

酶反应转板过程双人核对。2.

不同反应程序的选择。3.

磁珠使用前充分平衡、混匀。4.

仪器、试剂、人员操作记录完善。样本处理小结血浆分离DNA提取两步离心磁珠法文库构建末端修复、加A、加接头、PCRNIPT项目实验流程样本接收血浆分离数据分析DNA提取文库构建结果出具上机测序NIPT文库质控与Pooling目1

2100检测实验流程与关键质控点录23检测实验流程与关键质控点QubitPooling实验流程与关键质控点文库质控文库质控是指在给定的判定标准基础上，检测待上机测序文库是否达到该判定标准，能否满足上机测序要求。QualityQuantity文库质控为混合Pooling准备空白对照是否合格文库是否构建成功浓度是否符合要求是否有目的片段检测出来，片段大小是否符合要求；空白对照是否有污染环境污染样本混淆测序实验对文库浓度的范围要求，不符合范围的文库如何处理根据检测浓度，制定混合方案，保证数据产出的可控性Adaper污染文库质量检测-21002100检测原理•

DNA从孔道表面进入毛细管向前迁移，DNA双链小沟结合凝胶里的荧光集团进样分离检测•

电流方向改变，部分DNA向中心检测孔道迁移•

电压增大，不同片段大小的DNA移动速度不同，分子小的迁移较快•

荧光染料与DNA双链小沟结合，发出荧光•

不同大小的DNA分子先后通过激光探头，且荧光激发被检测内参：marker，ladder定性定量2100技术优势微孔操作，取样少操作简单，快速安全检测精确，结果直观DNA

LabChip（2100）2100操作流程点样制胶•

样品孔和Ladder孔各•

试剂盒提前平衡30min•

25ul凝胶与500ul染料混合•

离心过滤，避光保存（1个月）加5μLMarker•

Ladder孔加1μLLadder，样品孔加1μL样品压胶检测•

选择1000Kit试剂盒•

进行检测，观察Ladder峰图•

向标黑G孔中加入9μL凝胶染料•

压胶器压胶，最低档•

其余两G孔各加9μL•

仪器清洗2100检测峰图正常文库峰图异常情况处理异常文库峰图（接头二聚体污染）原

因

：末端修复或加A效率低；磁珠纯化时样本损失处理方法

：<3%忽略，3%-5%重新纯化，>5%建库失败异常情况处理异常文库峰图（杂尖峰）原

因

：通常由于仪器震动处理方法

：杂尖峰位置若影响数据分析，则重新测定文库浓度检测-QubitQubit®

3.0荧光计采用专门研制的荧光检测技术，荧光染料可与双链DNA特异性结合，发出荧光信号。跟据荧光信号的强弱可测定样本浓度。操作流程配制Qubit工作液避光•

计算缓冲液及荧光染料用量•

样本全部加完后避光2min•

配比：199μL缓冲液+1μL荧光染料•

整个过程勿触碰管外壁96例样本/h，操作快速，稳定性好，技术要求难度低加样检测•

标准曲线：190μL工作液+10μL标准品1,2•

标定标曲并进行校准测定•

标曲校准：198μL工作液+2μL标准品2•

测定样品浓度•

样品测定：198μL工作液+2μL待测样品注意事项

配制Qubit工作液以及分装，加样的过程中，注意避光，避免触碰Qubit管外壁部分

Qubit工作液配制完成后3h内保持稳定，与样本结合2min后反应稳定。

检测过一次的文库，切勿重复检测质控标准对于NIPT项目

经Qubit测得文库质量浓度×换算系数10（经验值），即为文库摩尔浓度

文库摩尔浓度＜40

nmol/L判定为建库失败。Pooling•

Pooling是什么？Pooling•

为什么要Pooling？•

要怎样进行Pooling？Pooling概念概念Pooling

是将不同的DNA文库按照一定的规则进行混合，将混合后的pooling文库进行上机测序，从而降低测序成本，提高测序通量。123N……规则根据每个文库所需数据量的不同制定不同混合比例，然后根据其Qubit浓度计算出混合体积，根据混合体积完成最后的操作。在相同数据量的需求下，浓度大的文库取样体积小，浓度小的取样体积大。简易理解为“数据量/浓度”一定的体积Pooling文库Pooling概念概念Pooling

是将不同的DNA文库按照一定的规则进行混合，将混合后的pooling文库进行上机测序，从而降低测序成本，提高测序通量。123N……Index不重复取样体积大于1μL，小于10uL取样时按照从大到小的原则操作过程双人核对一定的体积Pooling文库一次测序可同时检测94例样本+1例阳性质控品、1例阴性质控品文库质控与Pooling小结质量Pooling文库片段大小有无杂峰确定文库浓度样本混合，多个样品同时测序NIPT项目实验流程样本接收血浆分离DNA提取文库构建文库质控目录实验流程与关键质控点1

Nextseq

550AR2

数据分析与结果出具关键质控点测序原理边合成边测序-SBS(Sequencing

bySynthesis)Add4Fl-NTP’s+PolymeraseIncorporated

FI-NTP

imagedTerminator

&fluorescent

dyecleaved

fromFI-NTPX36-251测序原理可逆终止反应Next

Cycle•

合成•

检测•

去阻断•

切断荧光基团测序原理双色荧光的SBS–NextSeq550AR•

通过两种荧光信号通道检测•

一个簇产生绿色荧光为T•

一个簇产生红色荧光为C•

一个簇两种荧光都有为A•

一个簇两种荧光都没有为G影响测序结果的因素实验操作——防止污染文库质量——质控的重要变性稀释操作——精准操作测序仪的质量——环境测序操作测序操作下机数据查看ClusterPF（%）120100806040200Cluster

密度：数据量产出Cluster

PF：簇的通过率050100150200250300350Cluster密度（K/mm2）Q-score：质量分值，是对碱基读取正确概率的预测，分值越高，碱基读取质量越高，正确率越高。Q40：准确率99.99%Q30：准确率99.9%Q20：准确率99%%>=Q30下机数据记录仪器的清洁与保养-手动清洗•

检查液路（芯片、测序缓冲液），清空废液槽•

配置清洗试剂，0.05%的tween

20，0.12%的NaClOLoad1.

清洗芯片及试剂清洗板仪器自检仪器清洗步骤Check

2.3.

仪器运行Wash母体CNV过滤系统母亲携带的CNV会对胎儿染色体非整倍性的计算带来巨大影响原始的Z值结果系统修正后结果样本数据库拟合线安诺优达开发的母体CNV过滤系统，能够有效排除母体胎盘嵌合或孕妇本人染色体异常对胎儿检测结果的干扰，从而有效降低假阳性率。母体CNV过滤系统普通无创产前DNA检测结果

例数

准确度

特异性安诺CNV过滤无创产前DNA检测例数10820准确度99.97%100%100%——特异性99.97%100%100%——T21T18T13110

99.94%

99.94%21499.98%

99.98%99.