基因实验诊断培训班 RNA提取常见问题分析及对策

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NA提取常见问题分析及对策天津医科大学免疫学教研室白

虹2011-4P

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.RNA研究的重要性l

DNA，R

NA和蛋白质是三种重要的生物大分子，是生命现象的分子基础。l

DNA的遗传信息决定生命的主要性状，而mR

NA在信息传递中起很重要的作用。其它两大类R

NA，r

R

NA和t

R

NA，同样在蛋白质的生物合成中发挥不可替代的重要功能。l

因此mR

NA、r

R

NA、t

R

NA在遗传信息由DNA传递到表现生命性状的蛋白质的过程中举足轻重。P

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.RNA提取一、RN

A提取方法简介二、RN

A提取及常见问题分析P

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.分离提纯RNA的目的Ø

分析不同发育时期基因的表达状况Ø

获得新基因Ø

研究基因的拼接Ø

分析相应的蛋白产物P

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.RNA的不稳定性Ø

由于核糖残基的2’和3’位置带有羟基，RNA易于被RNA酶切割水解Ø

RNA酶含量丰富，加热后仍能够正确折叠恢复活性，不易失活P

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.提取RNA的注意事项Ø

经常更换新手套。因为皮肤和实验室用品上可能有RNase，会导致RNase污染。Ø

使用灭过菌的塑料制品和枪头避免交叉污染。Ø

应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4小时，塑料器皿可在0.5MNaOH中浸泡10分钟，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。P

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.常用RNA酶抑制剂Ø

焦磷酸二乙酯（DEPC）：

与RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，强烈但不彻底的RNA酶抑制剂

。Ø

异硫氰酸胍：目前是最有效的RNA酶抑制剂，裂解组织的同时也使RNA酶失活。既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。Ø

氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。Ø

RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。Ø

其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。P

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.RNA提取的步骤异硫氰酸胍，亚硫氢胍，巯基乙醇，N-月桂肌氨酸

等。使细胞及核蛋白复合物变性，释放RNA，有效抑制核酸酶。材料的裂解苯酚，氯仿，异戊醇抽提去除杂物，使DNA及蛋白沉淀到有机相。杂质的去除硅质材料的吸附或用异丙醇沉淀浓缩RNA。经DEPC处理的水溶解RNARNA的吸附或沉淀P

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.RNA提取的通用方法异硫氰酸胍/

苯酚法Ø

原理：•

细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放；•

释放出来的DNA和RNA由于在特定p

H下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分离；•

有机溶剂抽提，沉淀，得到纯净R

NA。P

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.Ø

步骤:•

材料准备：尽量新鲜。•

裂解变性：异硫氰酸胍

（使细胞及核蛋白复合物变性，释放R

NA，有效抑制核酸酶）。•

纯化分离：苯酚，氯仿，异戊醇。苯酚/

氯仿可抽提去除杂物。•

洗涤：70％乙醇。•

沉淀：异丙醇、无水乙醇。乙酸钠（pH4.

0）：维持变性的细胞裂解液的pH值，沉淀R

NA。此外还常用氯化锂选择沉淀R

NA。P

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.影响RNA提取的因素q

材料：Ø

新鲜，切忌使用反复冻融的材料Ø

如若材料来源困难，且实验需要一定的时间间隔。可以先将材料贮存在TRI

zol

或样品贮存液中，于－70℃或－20℃保存Ø

如要多次提取，请分成多份保存Ø

液氮长期保存，－70℃短期保存P

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样品破碎及裂解：Ø

根据不同材料选择不同的处理方法：•

培养细胞：通常可直接加裂解液裂解•

酵母和细菌：一般TRI

zol

可直接裂解，对于一些特殊的材料可先用酶或者机械方法破壁•

动植物组织：先液氮研磨和匀浆，后加裂解液裂解。期间动作快速，样品保持冷冻Ø

样品量适当，保证充分裂解Ø

为减少DNA污染，可适当加大裂解液的用量P

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.q

纯化：Ø

在使用氯仿抽提纯化时，一定要充分混匀，且动作快速；Ø

经典的纯化方法，如

Li

Cl

沉淀等，虽然经济，但操作时间长，易造成

R

NA

降解；Ø

柱离心式纯化方法：抽提速度快，能有效去除影响

R

NA

后续酶反应的杂质，是目前较为理想的选择。P

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.材料准备及裂解RNA的提取Ø

尽量使用新鲜材料，植物组织选取杂质少生长较快的幼嫩部位，现取现提。Ø

组培细胞及血液应尽量离心去除培养液和上清，消化系统的组织选取杂质少的部位,

细菌和酵母需要匀浆处理。Ø

对不能马上提取的样品切成小块后立即投入液氮冷冻，或投入专门的RNA样品储存液中保存。Ø

液氮研磨时不要使液氮挥发净，随时补充；加入裂解液并且彻底而迅速地匀浆。P

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.杂质的抽提RNA的提取Ø

采用有机（酚/

氯仿）抽提时应充分混匀Ø

离心分离两相时，应保证一定的转速和时间，使蛋白质、多糖和DNA分布到中间层和有机相中，R

NA留在水相中Ø

对脂肪含量较多的样品注意不要吸入油质层，可以再次用有机溶剂抽提P

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.RNA的沉淀和溶解RNA的提取Ø

含R

NA的水相过吸附柱，通过去蛋白液和漂洗液去除蛋白多糖等杂质Ø

或使用异丙醇沉淀R

NA应充分的混匀并放置10mi

n左右离心收集沉淀，70％乙醇洗涤，晾干Ø

用经DEPC处理过的水或专门的试剂来洗脱或溶解RNAØ

样品收集后或需长期保存时应置于－70℃

或加入RNase抑制剂，分装使用P

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.R

NA产物的鉴定|

R

NA的纯度与含量用紫外分光光度法检验。v

高纯度R

NA的A260/

A280应处于1.6至1.8之间，v

A260与R

NA浓度呈正比，1

OD

=

40μg/

ml

R

NA。|

R

NA的完整性可通过电泳检测v

R

NA为单链分子，二级结构复杂，需先经甲酰胺变性，再进行甲醛变性琼脂糖凝胶电泳。v

细胞总RNA以r

RNA含量最高，电泳时可观察到18S与28Sr

R

NA两条清晰条带，且亮度之比接近1:

2，表明R

NA没有发生降解。泳道前缘还可观察到一条较为模糊且亮度较弱的条带，主要由5S、5.8S

r

RNA

与t

R

NA组成。P

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NA电泳结果示意图28S18S5SP

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NA电泳结果凝胶成像图28S18S5

SP

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.RNA的检测Ø

电泳槽系统的处理Ø

乙二醛化琼脂糖凝胶电泳Ø

含有甲醛的琼脂糖凝胶电泳Ø

RNA纯度及浓度的检测（A260=1

，约40μg/mL

RNA；A

/A

约为1.9-2.1

）260280P

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.一、RN

A提取方法简介二、RN

A提取及常见问题分析P

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.RNA提取常见问题q问题一：

RNA样品不纯原因1

保证彻底的裂解和一定转数一定时间的离心；增加有机溶剂抽提的次数，用吸附柱纯化2

减少处理样品的量；加入不含RNas

e的DNas

e处理；再次纯化1

抽提过程不彻底存在蛋白或多糖多酚的污染2

DNA

的污染3

离子浓度较高对策3

增加漂洗次数P

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.RNA提取常见问题q问题二：

RNA得率低1

去除样品中的杂质，离心除净样品中的培养基或储存液原因2

减少样品用量；充分研磨样品，增加裂解液的用量和裂解的时间1

样品含有杂质杂液2

样品过量或样品裂解对策和匀浆不彻底3

R

NA未有效的吸附沉淀或洗脱3延长吸附时间或保证异丙醇沉淀的时间和离心时间；再次洗脱4

样品R

NA含量少4

重复吸附，加入肝糖等有助R

NA沉淀的试剂P

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.RNA提取常见问题q问题三：R

NA容易降解原因1

尽量取新鲜的样品；取样后立即放入液氮保存；或放入专门的储存液内；研磨样品及时补充液氮1

样品不新鲜或样品2

认真地处理相应的器具和试剂；严格地操作3

-

70℃

冻存，分装使用；加入RNas

e抑制剂保存不当，R

NA降解2

污染了RNas

e3

样品储存不当对策P

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.RNA提取常见问题q

RNA

的降解q

OD

/

OD

比值偏低260280q

电泳带型异常q

下游实验效果不佳P

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.RNA降解q

新鲜细胞或组织：Ø

裂解液的质量Ø

外源RNas

e的污染Ø

裂解液的用量不足Ø

组织裂解不充分Ø

另外某些富含内源酶的样品

(

如脾脏，胸腺等)

，很难避免

RNA

的降解。建议在液氮条件下将组织碾碎，并且匀浆时使用更多裂解液。P

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.RNA降解q

冷冻样品：Ø

样品取材后应立即置于液氮中速冻，然后可以移至-

70℃冰箱保存。样品要相对小一点；Ø

先用液氮研磨，再加裂解液匀浆；Ø

样品与裂解液充分接触前避免融化，研磨用具必须预冷，碾磨过程中及时补充液氮。P

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.OD

/

OD

比值偏低260280q

蛋白质污染：Ø

不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。Ø

减少起始样品量，确保裂解完全、彻底Ø

解决办法:

重新抽提一次，再沉淀，溶解。q

苯酚残留：Ø

不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。Ø

解决办法:

重新抽提一次，再沉淀，溶解。P

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.RNA的评价与鉴定l

纯度（OD260

/OD280）：紫外分光光度计进行测量（选择正确的稀释倍数，确保OD260

值在0.1~1.0之间，通常离心柱法稀释10倍左右；溶液裂解法稀释40－50倍）OD260

/OD280

<

1.9

～2.1

DNA污染OD260

/OD280＝

1.9

～2.1

纯度很好OD260

/OD280

>

1.9

～2.1

部分降解l

得率紫外分光光度计进行测量；Yield＝

OD260×稀释倍数×40ng/ul电泳检测：1％琼脂糖，6V/cm，15min，上样1～3

ulP

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.OD

/

OD

比值偏低260280q

抽提试剂残留：Ø

确保洗涤时要彻底悬浮

R

NA，并且彻底去掉

75%

乙醇。Ø

解决办法:

再沉淀一次后，溶解。q

用水稀释样品：Ø

测

OD

时，对照及样品稀释液请使用

10

mM

Tr

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s，pH

7.

5。用水作为稀释液将导致比值的降低。P

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.电泳带型异常q

非变性电泳：Ø

上样量超过

3ug，电压超过

6V/cm，电泳缓冲液陈旧，均可能导致

28S

和18S条带分不开。q

变性电泳条带变淡：Ø

EB

与单链的结合能力要差一些，故同样的上样量，变性电泳比非变性电泳要淡一些；Ø

甲醛的质量不高

。P

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.下游实验效果不佳q

RNA

降解q

抽提试剂的残留75%

乙醇洗涤q

样品中杂质的残留多糖等杂质，再次沉淀q

DNA

污染使用RNas

e-

Fr

ee

的

DNas

e

I

消化抽提RNAP

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.RT常见问题分析和解决方案问题一：少量或没有RT-PCR产物可能原因解决方案RNA降解分