原生质体融合育种(共57张PPT)

第一节微生物原生质体育种原生质体：1953年初次用宏大芽孢杆菌制备胜利1955年发现再生方法微生物原生质体的特点：对浸透压特别敏感对诱变剂的诱变效应更敏感失去对噬菌体的敏感性不受感受态的影响第一节微生物原生质体育种一、原生质体再生育种二、诱变育种三、转化育种四、交融育种五、其他微生物原生质体育种一、原生质体再生育种~：微生物制备原生质体后直接再生，从再生菌落中分别挑选变异株，最终得到优良性状提高的正变菌株原生质体再生育种正变率高于常规育种？制备和再生过程中相关要素微生物组成和构造改动普通选用对数期细胞制备原生质体不需求加遗传标志第一节微生物原生质体育种一、原生质体再生育种出发菌株选择菌种活化和预培育原生质体制备原生质体再生高产菌株分别二、原生质体诱变育种微生物制备原生质体后诱变处置，分别到再生培育基中再生，从再生菌落中分别挑选高产正变菌株二、原生质体诱变育种操作：物理诱变剂化学诱变剂特点：操作繁琐、技术要求高再生时间长、容易染菌P223扩展青霉PF-868原生质体诱变第一节微生物原生质体育种三、原生质体转化育种何种方式DNA转化率高？质粒第二节微生物原生质体交融育种微生物原生质体交融育种：经过人为方法，使遗传性状不同的两细胞的原生质体发生交融，并产生重组子的过程。聚乙二醇诱导电场诱导微生物原生质体交融育种的优点？1、大幅度提高亲本间重组频率2、扩展重组的亲本范围3、集中双亲本优良性状时机更大14原生质体交融技术的普通步骤交融亲本的选择与标志；原生质体的制备；原生质体的交融；原生质体的再生；交融子的选择与鉴定；目的菌株的挑选。一、直接亲本及其遗传标志的选择1.营养缺陷型、抗性标志、热致死孢子颜色、菌落形状等留意：多数营养缺陷型菌株会影响代谢产物的产量2.常把一方灭活后再交融3.可用不同荧光标志直接亲本3.可用不同荧光标志直接亲本提取拟南芥叶片的原生质体，并转化带有GFP标签的目的蛋白表达载体，瞬时表达察看目的蛋白在亚细胞中的定位情况红色为叶绿体自发荧光绿色为GFP的荧光。二、原生质体制备与再生制备过程：分别、搜集、纯化、活性鉴定、保管去壁方法：1.机械法2.非酶分别法3.酶法酶法分别原生质体：参考图9.3第二节微生物原生质体交融育种酶法分别原生质体的影响要素？〔1〕培育基组成放线菌参与亚适量甘氨酸黑曲霉第二节微生物原生质体交融育种酶法分别原生质体的影响要素？〔2〕菌体培育方式：1.平板玻璃纸法：丝状菌2.振荡沉没培育法细菌和酵母菌酶法分别原生质体的影响要素？〔3〕菌体年龄丝状真菌菌丝体尖端细胞放线菌对数期到静止期细菌对数期酵母菌菌体同步化酶法分别原生质体的影响要素？〔4〕稳定剂高渗溶液无机盐：NaCl、KCl、MgSO4、CaCl2有机物：蔗糖、甘露醇、山梨醇丝状真菌无机盐细菌蔗糖、氯化钠稳定剂常用浓度：0.3~1mol/L一、直接亲本及其遗传标志的选择第四节放线菌原生质体交融育种〔4〕稳定剂高渗溶液二、原生质体制备与再生放线菌甘氨酸二、原生质体制备与再生残存菌体的分别；原生质体再生的影响要素〔ｐ234〕第七节微生物原生质体交融育种可用不同荧光标志直接亲本第二节微生物原生质体交融育种再生时间长、容易染菌微生物制备原生质体后直接再生，〔３〕界面法离心后，原生质体在界面热〔５〕酶解前的预处置参与某种物质，抑制或阻止细胞壁某种成分合成酵母菌、丝状真菌巯基乙醇酵母菌EDTA放线菌甘氨酸细菌亚适量青霉素酶法分别原生质体的影响要素？〔６〕酶系和酶的浓度细菌、放线菌溶菌酶真菌蜗牛酶本卷须知：酶法分别原生质体的影响要素？〔７〕酶的作用温度和ｐＨ值酶的最适温度、菌株生长最适温度〔８〕菌体密度酶法分别原生质体的影响要素？〔９〕酶解方式运用培育皿分别效果好分别时坚持良好的通气条件、适当振荡分别条件经实验可确定如计算测定原生质体构成率第七节微生物原生质体交融育种如何计算测定原生质体构成率？原生质体构成率=〔A-B〕/A×100%细菌、酵母菌血球计数板计数法高渗再生培育基培育法霉菌、放线菌高渗再生培育基培育法二、原生质体制备与再生２．原生质体的鉴定〔１〕低渗爆破法p233

〔２〕荧光染色法荧光增白剂荧光显微镜二、原生质体制备与再生３．原生质体的搜集和纯化〔１〕过滤法适于丝状微生物〔２〕密度梯度离心法离心后，原生质体上浮〔３〕界面法离心后，原生质体在界面〔４〕漂浮法适于细胞较大的微生物二、原生质体制备与再生４．原生质体的活力测定〔１〕荧光素双醋酸盐染色法〔２〕酚藏花红染色法〔３〕伊文思蓝染色法二、原生质体制备与再生５．原生质体的保管液氮冷藏参与维护剂，如：二甲亚砜、甘油等二、原生质体制备与再生原生质体的再生：在高渗再生培育基上，原生质体重新合成细胞壁，恢复成完好细胞。参见p234图9.41.原生质体再生的影响要素〔ｐ234〕菌体生理形状稳定剂酶浓度和作用时间再生培育基组成残存菌体的分别；再生培育基上冷凝水原生质体密度、再生方法二、原生质体制备与再生２．再生率及其计算p236目的：找出最正确的原生质体制备和再生条件再生频率〔%〕=[〔C-B〕/〔A-B〕]×100%三、原生质体交融〔一〕原生质体交融过程P236〔二〕原生质体交融的影响要素１、交融剂２、温度３、亲株的亲和力和原生质体的活性４、无机离子〔二〕原生质体交融的影响要素１、交融剂化学交融剂：PEG不同微生物适宜不同相对分子质量的PEG真菌4000-6000细菌1500-6000物理交融剂：电场、激光〔二〕原生质体交融的影响要素１、交融剂电场交融的优点：适于动植物、微生物细胞；交融频率高可在显微镜下察看〔二〕原生质体交融的影响要素１、交融剂２、温度20~30℃３、亲株的亲和力和原生质体的活性４、无机离子PEG介导交融钙离子、镁离子电场交融糖或糖醇四、交融体再生复原：再生培育基细胞壁重建构成菌落P239图9.8四、交融体再生〔二〕交融体的检出和分别1.利用营养缺陷型标志选择交融体双亲原生质体的交融体构成菌落亲本不能在根本培育基上生长消费育种不常用，可用于遗传研讨〔二〕交融体的检出和分别2.利用抗药性选择交融体营养缺陷型和抗药性结合挑选P240〔二〕交融体的检出和分别3.用灭活原生质体检出交融体灭活方法：药物紫外线温度〔二〕交融体的检出和分别4.利用荧光染色法亲本分别带上不同颜色荧光交融后直接根据荧光颜色选出交融体本卷须知：四、交融体再生〔二〕交融体的检出和分别察看形状生化目的测定DNA含量：分光光度计五、交融重组体检出与遗传特性分析〔一〕重组体的检出和鉴别方法1、直接法图9.92、间接选择法图9.103、钝化选择法〔灭活一方原生质体〕五、交融重组体检出与遗传特性分析〔二〕交融率见表9.2五、交融重组体检出与遗传特性分析〔三〕DNA含量及孢子形状测定1、DNA含量测定2、单倍化3、酶活性及孢子体积测定4、分子生物学方法六、原生质体交融的运用1、提高产量或质量，合成新物质2、改良菌种遗传特性3、优化菌种发酵特性4、质粒转移5、原生质体与细胞核交融6、进展遗传分析第三节细菌原生质体交融育种细菌细胞壁如何降解？P247

第三节细菌原生质体交融育种1.如何提高细菌原生质体制备率和再生率？〔1〕预处置：目的改动细胞壁的性质〔2〕溶菌酶：〔3〕细菌生理形状：对数期〔4〕培育基和培育条件：第三节细菌原生质体交融育种2.建立最正确交融体系PEG相对分子质量：4000~6000浓度：40%~50%交融时间：30min第三节细菌原生质体交融育种〔三〕操作方法p251斜面活化两代液体振荡培育第四节放线菌原生质体交融育种〔二〕菌体培育及预处置水解酶：溶菌酶预处置：加甘氨酸第五节酵母菌原生质体交融育种一、酵母细胞壁构造和遗传标志菌龄对原生质体构成影响大亲本灭火的方法：紫外线热药物第五节酵母菌原生质体交融育种一、酵母原生质体制备p259预处置：EDTA；巯基乙醇蜗牛酶第二节微生物原生质体交融育种〔１〕过滤法适于丝状微生物〔二〕交融体的检出和分别酶法分别原生质体：参考图9.交融后直接根据荧光颜色选出交融体霉菌、放线菌高渗再生培育基培育法放线菌