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文档简介

PAGEPAGE2人血清中抗核抗体（Anti-nuclearAntibody,ANA）检测间接免疫荧光法（IFA）【目的】1.掌握IFA原理2.熟悉人血清中抗核抗体的检测方法.3.了解荧光显微镜的结构及使用方法【临床意义及检测原理】抗核抗体（ANA）是自身抗体中的一组抗体，指抗细胞内所有抗原成分的自身抗体的总称。ANA靶抗原分布于整个细胞，包括细胞核、细胞浆、细胞骨架、细胞分裂周期蛋白等。ANA阳性的疾病很多，最常见于弥漫性结缔组织病，如系统性红斑狼疮（SLE）、干燥综合征（SS）、类风湿关节炎（RA）、硬皮病（SSc）等。在某些非结缔组织病和正常老年人也可以出现低滴度的阳性。ANA检测在临床上是一个极重要的筛选试验，ANA阳性（高滴度）标志了自身免疫性疾病的可能性，ANA检测对风湿性疾病的诊断和鉴别具有重要意义。Hep-2（人喉癌上皮细胞）细胞核抗原丰富、特异性强、核大、细胞结构清晰、易于进行结果观察及荧光染色核型分析。本实验以Hep-2细胞作为抗原，采用间接免疫荧光法，在抗原与病人血清中ANA反应后，加入荧光素标记的兔抗人IgG抗体，最终在荧光显微镜下观察结果。【试剂】1.Hep-2抗原片：人喉癌上皮细胞待检血清ANA阳性对照（阳）ANA阴性对照（阴）荧光标记二抗（二）洗涤液（PBS-T）、蒸馏水封片剂盖玻片【器材】1ml、10ul微量移液器、1.5mlEP管、荧光显微镜。【操作步骤】2人/组，3个抗原片3213211.待检血清的稀释：用微量移液器吸取洗涤液1000ul于1mlEP管中，再加入待检血清10ul，即为1:100稀释液，混匀备用。2.加样：在倒扣板的反应孔内分别加入稀释的待检血清（1号片）和阴、阳性对照（2,3片），25ul/孔。注意：加样时避免产生气泡。3.孵育：将抗原片盖在倒扣板对应的凹槽里，室温孵育30min。注意：确保每个标本均能与抗原基质相接触，而标本之间不相互接触。4.洗涤：取出抗原片，用洗涤液轻轻从一侧将反应液洗掉，浸泡在洗片缸内，静置5min后，再用蒸馏水冲洗1次。5.加二抗：在倒扣的反应孔内加入荧光素标记的二抗，25ul/孔。注意：加样时避免产生气泡。6.孵育：用滤纸擦去抗原片周边和反面多余的液体后，将抗原片盖在倒扣板对应的凹槽里，室温孵育30min。注意：确保每个标本均能与抗原基质相接触，而标本之间不相互接触。7.洗涤：同38.封片：在盖玻片上滴加封片剂。用滤纸擦干抗原片周边和反面多余液体后，将载片的抗原基质朝下置于准备好的盖玻片上，完成封片。9.结果观察：荧光显微镜下观察结果。200倍、400倍镜下判断具体核型。【结果判断】常见的荧光染色模型有下述6种：均质型：胞核荧光均匀一致，分裂期细胞染色体呈浓集染色。斑点型：胞核内荧光呈不同程度的斑点或斑块状，核仁有时阳性。核仁型：核仁染色核膜型：荧光染色集中在核膜边缘，核中央渐趋暗淡

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