罗红霉素胶囊微生物限度检查方法验证

STP-QC-HY-007-00检验方法验证方案罗红霉素胶囊微生物检验方法学验证方案浙江花园药业概述罗红霉素（Roxithromycin），英文别名：Claramid、Rulid，是新一代大环内酯类抗生素，主要作用于革兰氏阳性菌、厌氧菌、衣原体和支原体等。其体外抗菌作用与红霉素相类似，体内抗菌作用比红霉素强1—4倍。罗红霉素胶囊为该药物的固体产品。验证目的2010年版药典中未明确指出罗红霉素胶囊的微生物检验方法，所以现在为了得到一个可行的、可控的、科学的微生物检验方法，特进行一系列的对稀释剂、抑菌剂等方面的方法学验证活动。验证依据3.1《中国药典》2010年版二部附录ⅪJ3.2《中国药品检验标准操作规程》2010年版四、实验用品4.1供试品次数品名规格批号来源1浙江花园药业234.2培养基名称批号厂家营养琼脂培养基北京三药科技开发公司玫瑰红钠培养基营养肉汤培养基改良马丁培养基改良马丁琼脂培养基胆盐乳糖培养基培养基的配制方法均按照厂家说明书要求进行配制，符合《中国药典》2010年版的要求。4.3缓冲液名称批号厂家杭州微生物试剂4.4验证菌种：名称菌种编号菌龄来源大肠埃希菌CMCCB（B）44102—金华食品药品检验所金黄色葡萄球菌CMCCB（B）26003—枯草芽孢杆菌CMCCB（B）63501—白色念珠菌CMCCB（F）98001—黑曲霉CMCCB（F）98003—4.5菌液制备4.5.1大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌：取少量的三种菌种的新鲜培养物接种至5ml营养肉汤培养基上，在30～35℃培养18～24小时后，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释制成每1ml中含50～100cfu的菌悬液。4.5.2白色念珠菌：取少量的白色念珠菌的新鲜培养物接种至5ml改良马丁培养基上，在23～28℃培养24～48小时，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释制成每1ml中含54.5.3黑曲霉：取少量的黑曲霉的新鲜培养物接种至5ml改良马丁琼脂斜面培养基上，在23～28℃培养5~7天，加入3~5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱后移置无菌管中，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液稀释制成每1ml中含50～100cfu的孢子悬液。4.6菌落计数取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌各50~100cfu，分别注入无菌平皿中，立即注入15~20ml营养琼脂培养基，混匀，待凝固后，置30~35℃培养48小时，计数；取白色念珠菌、黑曲霉各50~100cfu，分别注入无菌平皿中，立即注入15~20ml玫瑰红钠培养基，混匀，待凝固后，置23~28℃培养72小时，计数。结果大肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉12平均操作人/日期：复核人/日期：五、检查法验证5.1细菌、霉菌和酵母菌检查5.1.1预实验5.1.1.1供试品配制：将供试品用稀释配制成1:10的供试品溶液。5.1.1.2菌液：白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌5.1.1.3平皿法：取供试品溶液1ml注入三个营养琼脂培养基平皿中，第一个平皿中加入1ml金黄色葡萄球菌，第二个平皿中加入1ml枯草芽孢杆菌，第三个平皿中加入1ml白色念珠菌，另做一空白对照，培养72h后，计算每种菌种的回收率。实验结果：菌种计数结果空白对照回收率金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌操作人/日期：复核人/日期：5..4培养基稀释法：取供试品1ml分别按0.5ml/皿和0.2ml/皿的添加量分别加入2个和5个营养琼脂培养基平皿中，然后分别将金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌各1ml按照供试品溶液的加入法，分别加入到各个平皿中，另做一空白对照，培养72h后，计算每种菌种的回收率。实验结果：菌种计数结果回收率1ml1ml金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌空白对照——操作人/日期：复核人/日期：5..5薄膜过滤法：取供试品1ml通过薄膜过滤，分别用200、400、600、800ml冲洗，分别在每张膜上加1ml金黄色葡萄球菌、1ml枯草芽孢杆菌、1ml大肠埃希菌，放置在营养培养基上，另做一空白对照，培养72h后，计算每种菌种的回收率。实验结果：菌种计数结果回收率200ml400ml600ml800ml200ml400ml600ml800ml金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌大肠埃希菌空白对照——操作人/日期：复核人/日期：实验总结：操作人/日期：复核人/日期：5.1.2实验方法计数方法：根据上述预实验结果，可以得出选用来进行供试品的细菌检查，霉菌和酵母菌检查可用。5.1.2.。5.1.2.3供试品处理方法：取供试品，称取10g，加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml，摇匀制成1:10的供试液。5.1.2.4操作步骤5.1.2.4.1细菌检查：5.1.2.4.2霉菌和酵母菌计数：5.1.2.5实验次数：每项实验进行三次。5.1.3试验内容5.1.3.1供试品组：取1:10的供试液按照5.1.2.4.1及5.1.2.4.2描述的方法进行试验，按每1ml供试液加入50~100cfu试验菌，结果记录在下表：次数大肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉123平均操作人/日期：复核人/日期：5.1.3.2活菌组：参见的菌落计数结果。5.1.3.3供试品对照组：参照5.1.3，结果记录在下表：菌落数实验次数第一次第二次第三次细菌霉菌和酵母菌操作人/日期：复核人/日期：5.1.3.4稀释剂对照组：用pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲代替供试品，照供试品组检查法同法处理，结果记录在下表中：次数大肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉123平均操作人/日期：复核人/日期：5.1.4验证结果5.1.4.1供试品组的回收率次数大肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉123平均计算公式：供试品组的回收率%=供试品组平均菌落数-空白组平均菌落数×100%活菌组的平均菌落数操作人/日期：复核人/日期：5.1.4.2对照组的回收率次数大肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉123平均计算公式：供试品对照组的回收率%=对照组平均菌落数×100%活菌组的平均菌落数操作人/日期：复核人/日期：5.2控制菌检查因本品为口服固体制剂，所以按照《中国药典》中的规定，必须要检测大肠埃希菌，选用金黄色葡萄球菌为阳性对照菌。5.2.1验证试验：按照5.1.2.3的方法配制供试品溶液。5.2.1.1常规法5.2.1.1.1试验组：取供试品溶液10ml和1ml含50~100cfu的大肠埃希菌的菌液，加入到100ml胆盐乳糖培养基中，30~35℃培养18~24小时。5.2.1.1.2阳性对照组：取50~100cfu的大肠埃希菌菌液加入到100ml胆盐乳糖培养基中，30~35℃培养18~24小时。5.2.1.1.3阴性对照组：取pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液10ml加入到100ml胆盐乳糖培养基中，30~35℃培养18~24小时。5.2.1.2实验结果试验次数第一次第二次第三次试验组阳性对照组阴性对照组操作人/日期：复核人/日期：5.2.1.2培养基稀释法5.2.1.1.1试验组：取供试品溶液10ml和1ml含50~100cfu的大肠埃希菌的菌液，加入到200ml胆盐乳糖培养基中，30~35℃培养18~24小时。5.2.1.1.2阳性对照组：取50~100cfu的大肠埃希菌菌液加入到200ml胆盐乳糖培养基中，30~35℃培养18~24小时。5.2.1.1.3阴性对照组：取pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液10ml加入到200ml胆盐乳糖培养基中，30~35℃培养18~24小时。5.2.1.实验结果试验次数第一次第二次第三次试验组阳性对照组阴性对照组操作人/日期：复核人/日期：5.2.1.3离心集菌薄膜过滤法：取项下配置好的溶液在500r/min离心3分钟，取上清液10ml加到200ml稀释液中，混匀，作为控制菌检查供试液，冲洗液的量可参考。试验组：取供试品溶液10ml通过薄膜过滤，在最后一次冲洗液中加入1ml含50~100cfu的大肠埃希菌的菌液，将滤膜放入到100ml胆盐乳糖培养基中，30~35℃培养18~24小时。5.2.1.3.2阳性对照组：取1ml含50~100cfu的大肠埃希菌菌液通过薄膜过滤并用冲洗液冲洗，将滤膜放入到100ml胆盐乳糖培养基中，30~35℃培养18~24小时。5.2.1.3.3阴性对照组：取pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液10ml通过薄膜过滤，将滤膜放入到100ml胆盐乳糖培养基中，30~35℃培养18~24小时。5.2.1.3.4实验结果试验次数第一次第二次第三次试验组阳性对照组阴性对照组操作人/日期：复核人/日期：七、验证总结7.1细菌、霉菌和酵母菌在细菌