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文档简介

免疫荧光染色直接法单位：沧州医学高等专科学校讲师：李红岩免疫荧光染色直接法原理12345将抗体标记上荧光素形成有荧光素的抗原-抗体结合物荧光显微镜观察荧光抗体与组织细胞抗原结合激发光(紫外光)照射,荧光素发出可见荧光免疫荧光染色直接法冷冻切片和细胞涂片固定后蒸馏水洗.PBS洗。滴加荧光标记一抗工作液孵育45分钟,37℃。PBS洗5分钟,3次。晾干或甩去PBS用缓冲甘油封片。010203染色步骤04免疫荧光染色直接法染色结果阳性结果荧光呈明暗不一的亮黄绿色(FITC标记抗体)或橙红色(TRITC标记抗体)。免疫荧光染色直接法方法评价用荧光素标记的一抗直接与组织细胞特异性结合。但由于没有将抗原一抗体结合物放大，所以敏感性不及间接法。优点是操作步骤少,染色快速,几乎没有非特异性背景染色;缺点是抗体种类不多。直接法中只有抗原抗体特异性结合，没有连接其他抗体，所以特异性极高，非特异性染色少。免疫荧光染色直接法应用目前荧光一抗主要用于肾穿刺和皮肤的病理诊断。多数是兔源抗体,标记异硫氰酸荧光素（FITC）。免疫荧光染色直接法荧光显微镜的使用1.要提前打开荧光显微镜电源,超压汞灯开启15分钟后光源稳定,适合观察。开启光源后每次使用不超过2小时,超过2小时光亮强度逐渐下降,观察到的荧光也会变弱。关闭光源后需要等灯泡冷却后才能再次开启,否则影响灯泡寿命。

2.荧光显微镜应安装紫外光挡板或在观察时戴上防护眼镜,防止紫外光损害眼睛。3.用高倍油镜观察时,应选用无荧光镜油,避免非特异性荧光干扰。

4.拍摄荧光图像时,应选用较高的ISO感光度模式。

免疫荧光染色直接法免疫荧光染色质量控制免疫荧光染色质量控制与免疫组织化学染色质量控制基本相同。

此外,

免疫荧光染色后,染色片放置时间长荧光会慢慢衰减,因此,应及时观察,否则荧光衰减会导致阳性强度的错误判断或出现假阴性。

观察时,

光源长时间照射标本,

会加快荧光淬灭,

应避免长时间观察同一标本。

如果用石蜡切片行免疫荧光染色,

则必须彻底脱蜡,

否则石蜡会有青色荧光发出,影响观察。

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