实验29氨基转移反应的定性鉴定实验报告

实验29氨基转移反应的定性鉴定实验报告学生姓名 唐思亮学号 专业化学与环境学院年级、班级2007级理科综合二班课程名称_生物化学实验_实验项目氨基转移反应的定性鉴定实验类型□验证□设计□综合实验时间2008年11月24日实验指导老师陈文利老师实验评分 一、 实验目的1、 学习一种鉴定氨基转移作用的简便方法及其原理；2、 进一步掌握纸层析的原理和操作技术；3、 了解氨基转移作用在中间代谢中的意义。二、 实验原理氨基移换酶也称转氨酶，它能催化a-氨基酸的氨基与a-酮酸的a-酮基互换，这种作用称为氨基移换作用。它在生物体内蛋白质的合成与分解等中间代谢中，在糖、脂肪、蛋白质三类物质代谢的相互联系、相互转化上，都起着很重要的作用。任何一种氨基酸进行转氨作用时，都由其专一的转氨酶催化。它们的最适pH接近7.4。在各种转氨酶中，以谷氨酸一草酰乙酸转氨酶（简称谷草转氨酶、GOT）及谷氨酸一丙酮酸转氨酶（简称谷丙转氨酶、GPT）活力最强。它们催化的反应如下：COOHCINCOOHCINCH.+c=oCOOHCOOHCHll-C-NII.COOHCOOHCH-風十H-CNH：COOHCOOHCH,旦Ic=oC00IICt—酮戊—酸天I'J冬氨酸COOHCH札+H-CNH-COOHCH3.gpt-c=oCOOHCOOHCH-CH.+c=oCOOHa一酮戊一酸CH.H-C-NH；.COOH丙氨酸上述两种酶均广泛存在于生物机体中，在正常人血清中也有少量存在。机体发生肝炎、心肌梗塞病变时，血清中转氮酶活力显著增加，在临床上转氨酶活性的测定有重要意义。测定转氨酶活性的方法很多，如分光光度法，纸上层析法及光电比色法等。本实验利用纸层析法，检查由谷氨酸和丙酮酸在谷丙转氨酶的作用下所生成的丙氨酸，证明组织内氨基移换作用。为了防止丙酮酸被组织中其它酶所氧化或还原，可加碘乙酸或溴乙酸抑制酵解作用或氧化作用。三、实验材料、试剂和器具实验动物：家兔(饥饿16h)试剂1%谷氨酸溶液(用KOH中和至中性)1%丙酮酸溶液(用KOH中和至中性)l/15mol/LpH7.4磷酸缓冲液(pH=7.4)0.1%碳酸氢钾溶液0.05%碘乙酸溶液30%乙酸标准丙氨酸溶液(0.5%)标准谷氨酸溶液(0.5%)0.1%水合茚三酮乙醇溶液酚溶剂：在大烧杯中，加蒸馏水40ml，再加入新蒸馏的无色的苯酚150g。在水浴中加热搅拌，混合至酚完全溶解。将该溶液倒入盛有120ml蒸馏水的500ml分液漏斗内，轻轻振荡混合，使其成为乳状液。静置7-10h，乳状液变成两层透明的溶液，下层为被水饱和的酚溶液(即酚溶剂)，放出下层，贮存在棕色试剂瓶中备用。器具解剖刀、剪及镊子(3)解剖刀、剪及镊子(3)表面皿⑸台秤(7)试管及试管架(9)毛细玻璃管2H铅笔⑷匀浆器。离心管和离心机(台式)(8)恒温水浴锅(10)直尺层析滤纸(国产新华1号滤纸)，漏斗电热鼓风干燥箱(实验过程中用电热吹风代替)层析用具：玻璃钟罩、层析缸和小烧杯喷雾器如图：四、实验操作以及现象

一）酶液的制备（实验前已完成）将兔击晕，迅速解剖，取出肝脏，在低温条件下剪碎。用表面皿称取1.5g肝脏，放入匀浆器中，再加入3ml磷酸缓冲液。研成匀浆后，倒入离心管中，在2500r/min的条件下，离心5min，取上清液，即为制备的酶液。流程肝的处理研磨准备研磨离心分离操作将兔击晕，迅速解剖，取出肝脏，在低温条件下剪碎。用表面皿称取1.5g肝脏，放入匀浆器中，再加入3ml磷酸缓冲液。研成匀浆把匀浆倒入离心管中，在2500r/min的条件下，离心5min，取上清液。分析控制条件和速度，保持肝内酶的活性。缓冲液的pH值为酶的最适pH,也是为了保持下步酶的活性考虑。破坏细胞结构，释放酶进入匀浆。酶是蛋白质，溶于缓冲液呈清液。附注：实际实验中，酶液是肉红色匀浆状，新鲜制备，低温保存的。另一份对照组直接使用煮沸的肝匀浆上层白色浊液。二）体外氨基移换反应——酶促反应取干净的试管两只，按下表编号后，分别加入各试剂，进行操作。编号试剂 〜1（样品）2（对照）1%谷氨酸溶液10滴10滴1%丙酮酸溶液10滴10滴1/15mol/LpH7.4磷酸缓冲液2ml2ml0.05%碘乙酸5滴5滴酶液2ml--30%乙酸--5滴（本次实验未滴加）煮沸过的酶液--2ml实验现象（如下图）肉红色溶液淡乳色溶液立刻摇匀，置于37°C恒温水浴中保温40min30%乙酸5滴5滴实验现象肉红色略变暗淡乳色溶液摇匀，进行100C沸水浴10min实验现象有棕色沉淀产生淡乳色溶液流水冷却，过滤，收集滤液实验现象滤液显淡乳色溶液略深，过滤困难滤液显淡乳色溶液现象分析乙酸，使谷丙转氨酶变性失变暗。再于沸水中加热，酉酶蛋白沉淀，失去了催化作并且堵塞滤纸,三活，但并不彻底，肉红色桂彻底变性失活，谷丙转氨F用，（有棕色沉淀产生）使过滤困难。1（样品） 2（对照）在37°C恒温水浴锅中保温40分钟之前图（三）纸上层析法检查1、 点样两人合用一张15cm直径的圆形滤纸，在圆心处用圆规划一个直径3cm的同心圆。在同心圆的圆周上取4个点，每个点的距离相同，这是四个点样的位置（标准丙氨酸溶液、标准谷氨酸溶液、对照上清液、样品上清液）。点样时，将毛细管口轻轻触到滤纸上，使每种溶液分别形成直径为2-3mm的圆斑，每次点样后，自然风干或吹风机吹干，再点下一次，重复3-4次，点样量应均匀相等。（此时也可用电热风吹干，但是样品不可以过于受热，以免氨基酸损失）2、 纸上层析分离氨基酸在15cm直径的圆形滤纸中心剪一个小圆孔，取一层析滤纸卷成圆筒，用剪刀将该圆筒状的滤纸的下端沿纵向剪为灯刷状，而滤纸的上端卷起，插入至15cm直径的圆形滤纸的小圆孔中，即成“灯芯”圆筒状的滤纸灯刷状的一端放在盛有层析剂的培养皿中，灯刷状的滤纸和层析剂（酚溶液）相接触。注意：酚有腐蚀性，操作过程中要戴上手套。培养皿上盖上大小一样的培养皿，纸上层析开始。待层析剂（酚溶液）展开至15cm直径的圆形滤纸边缘1cm时，纸上层析结束。

3、纸上层析中氨基酸的鉴定取出滤纸，拔去“灯芯”，晾干或吹干，以除去酚溶剂。(实验中，我们使用电热吹风吹干，样品同样不可以过于受热，以免氨基酸损失)用喷雾器向滤纸均匀喷洒0.1%茚三酮乙醇溶液注意：茚三酮有毒性，不可对人喷，选择窗边顺风风向喷滤纸。用风筒吹热风使滤纸中温度加热至60-80°C，氨基酸与茚三酮反应，使氨基酸显色，在滤纸上呈现紫红色斑点。计算Rf值(0<Rf<1),确定氨基酸的种类。我们组茚三酮染色完成图 文婷小组茚三酮染色完成图第一次吹干茚三酮乙醇溶液时，吹风筒距离滤纸不够近，加热不足60-80C，只有浅浅的紫红色。于是重新喷茚三酮乙醇溶液染色，再次吹干时，风筒紧贴着滤纸，滤纸受热，颜色加重，并且3号点样处原本只有一个紫红斑点，后来呈现了第二个。我们组3号点样处有两条紫红色斑带，点样点2、3、4各有一条，每条斑带都轮廓清楚，说明点样得较好。3号点样处两天色带不呈圆弧状分布，我分析可能原因是取出滤纸染色之前，喷洒茚三酮乙醇溶液染色时，我们竖着拿滤纸，使茚三酮乙醇溶液染成的紫红色流淌下来，形状就成了反向弧滤纸本身制裁缘故，如果本身实验中滤纸被弯曲折痕，也会有影响。另一个图片是文婷小组茚三酮染色完成图，她们组染色的斑点清晰，呈规则椭圆，只是颜色较浅，可以重新染色，解决此问题。4、计算Rf值(相对迁移率)公式为

样品移动距离样品染色斑点中心与点样处之间的距离溶剂前沿与点样处之间的距离Rf（相对迁移率）=———————溶剂移动距离溶剂前沿与点样处之间的距离实验数据如下：编号移动（cm）））\、1.标准丙氨酸溶液2.标准谷氨酸溶液3•样品上清液4.对照上清液样品移动距离13.32.21.71.5样品移动距离2————2.6——溶剂移动距离4.54.04.23.7根据实验数据计算各溶剂的Rf值为标准标准丙氨酸Rf=3.4=0.7564.5标准标准谷氨酸Rf-2.2ncc4.0=0.55样品1中丙氨酸Rf=2.6nzrin4.2=0.619样品1中谷氨酸Rf=1.7njnc4.2=0.405对照2中谷氨酸Rf=1.5njnc3.7=0.405根据色带图谱的数据一一3号点样处中迁移的快的色带相对迁移率Rf=0.619与标准丙氨酸溶液的Rf=0.756接近，3号点样处中迁移的慢的色带的Rf=0.405以及4号点样处中的斑带的Rf=0.405与标准谷氨酸溶液的Rf=0.55接近。本实验是定性鉴定，只考虑各氨基酸的相互之间的相对迁移率，而不精确要求其值的准确度，样品液及对照液的谷氨酸迁移率（Rf=0.405）与标准液（Rf=0.55）有一定差距。所以：3号点样处迁移的快的斑带是丙氨酸，迁移得慢的斑带是谷氨酸。3号点样处的色带是谷氨酸。3号点样处（1号样品上清液）中谷氨酸在谷丙转氨酶催化作用下，转化为丙氨酸，可逆反应平衡后，丙氨酸和谷氨酸均存在。纸上层析后出现两条氨基酸紫红色带。4号点样处（2号对照组溶液）中谷丙转氨酶因煮沸而变性失活，不具有催化作用，紫红色带应该是谷氨酸。五、 关键步骤与注意事项1、 在低温下取动物新鲜组织制新鲜肝糜，制备酶液进行实验，防止酶失活，确保肝内酶活力。2、 加碘乙酸抑制酶解作用。六、 思考与总结关于层析法在层析实验中，分子的迁移率受其所带净电荷量、分子量、固定相、流动相等等，各种因素的影响。谷氨酸的相对分子质量为167,丙氨酸的相对分子质量为89。谷氨酸带有负电荷，极性更强。本实验的固定相是滤纸，流动相是苯酚，滤纸中纤维素的羟基与苯酚的羟基形成氢键，苯酚能在滤纸上较好地展开。根据相似相容原理，谷氨酸的分配系数相对小于丙氨酸的分配系数。【1】氨基移换酶也称转氨酶，它能催化a-氨基酸的氨基与a-酮酸的a-酮基互换，这种作用称为氨基移换作用。（I. COOH「Clh 卩OH它在生物体内蛋白质的合成与分解等中间代谢中在糖Cl脂肪、蛋白质三类物质代谢的相互联系、相互转化上，都起着很重要的作用。丨』NH.任何一种氨基酸进行转氨作用时，都由其专一的转氨酶催化。它们的最适pH接近7.4。在各种转氨酶中，以谷氨酸—草酰乙酸转氨酶（简称谷草转氨酶、GOT）及谷氨酸一丙酮酸转氨酶（简称谷丙转氨酶「gp^T）活力最强。它们催化的反应如下：COOHCOOHCHrpT CH,-+CH.-CH +ch3、门2FH-CNH-c=o1c=o1H-C-NH...COOHCOOHCOOHCOOH-谷氨酸丙酮酸a-酮戊一酸