酶的化学修饰

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微生物酶发酵制药技术酶的化学修饰

酶的化学修饰

什么是酶化学修饰？通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的技术过程称为酶分子修饰。即：在体外将酶分子通过人工的方法与一些化学基团（物质），特别是具有生物相容性的物质，进行共价连接，从而改变酶的结构和性质。酶化学修饰的意义提高酶的活力；增强酶的稳定性；降低或消除酶的抗原性；研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金属离子和各种物理因素对酶分子空间构象的影响酶分子的修饰方法

大分子修饰酶的表面化学修饰小分子修饰交联修饰固定化修饰非催化活性基团的修饰蛋白主链的修饰酶分子内部修饰催化活性基团的修饰辅助因子的修饰肽链伸展的修饰结合定点突变的修饰1.酶的表面化学修饰（1）大分子修饰可溶性大分子通过共价键连接在酶分子表面，形成覆盖层。应用最广泛的是：PEG类修饰，分子量为500-20000。（2）小分子修饰利用分子化合物对酶的活性部位或活性部位之外外的侧链基团进行化学修饰，以改变酶学性质。广泛使用的小分子化合物有：氨基葡萄糖、乙酸酐、硬脂酸等。（3）交联修饰使用双功能试剂，如戊二醛、PEG等将酶蛋白分子之间、亚基之间或分子内不同肽链部分间进行共价交联，可提供其稳定性，增加其在水溶液中的使用价值。（4）固定化修饰通过酶表面的酸性或碱性残基，将酶共价连接到惰性载体上后，由于酶所处的微环境改变，会使酶的性质发生改变。2.酶分子内部修饰（1）非催化活性基团的修饰最经常修饰的残基可以是亲核的，也可以是亲电的，或是可氧化的。修饰后酶的催化动力学性质发生改变。（2）蛋白主链的修饰(肽链有限水解修饰)利用酶分子主链的切断和连接，使酶分子的化学结构及其空间结构发生某些改变，从而改变酶的特性和功能的方法。蛋白主链修饰主要靠酶法。如：将猪胰岛素转变成人胰岛素。（3）催化活性基团的修饰对催化活性基团可以通过选择性修饰侧链成分来实现氨基酸的取代。（4）辅助因子的修饰有以下三个方面①不是共价结合的辅助因子，可将辅助因子共价结合到酶上；引入新的或修饰过的辅助因子；②将新的辅酶引入结构已经清楚的蛋白质上；③金属酶中金属离子的取代。3.结合定点突变的化学修饰现在常用的氨基酸置换修饰的方法是定点突变技术。定点突变是20世纪80年代发展起来的一种基因操作技术。是指在DNA序列中的某一特定位点上进行碱基的改变从而获得突变基因的操作技术。是蛋白质工程和酶分子组成单位置换修饰中常用的技术。定点突变技术，为氨基酸或核苷酸的置换修饰提供了先进、可靠、行之有效的手段。酶修饰后的性质变化1.热稳定性：一般来说，热稳定性有较大的提高。2.各类失活因子的抵抗力：修饰酶对蛋白酶、抑制剂均有一定的抵抗能力，从而提高其稳定性。3.抗原性：比较公认的是PEG和人血清白蛋白在消除酶的抗原性上效果比较明显。4.半衰期：一般在体内的半衰期得到有效延长。由于酶分子经修饰后，增强对热、蛋白酶、抑制剂等的稳定性，从而延长了在体内的半衰期。5.最适pH：大部分酶经化学修饰后，酶的最适pH发生了变化，这种变化在应用研究上有时具有重要意义。修饰酶最适pH更接近于生理环境，在临床应用上有较大意义。6.Km的变化：大多数酶经修饰后，Vm没有明显变化，但有些酶经修饰后，Km值变大。7.对组织分布能力改变：一些酶经修饰后，对组织的分布能力有所改变，能在血液中被靶器官选择性吸收。项目3

生产工艺过程1213固定化酶产品介绍氨基酰化酶：这是世界上第一种工业化生产的固定化酶，可以用于生产各种L-氨基酸药物。1969年，日本田边制药公司将从米曲霉中提取分离得到的氨基酰化酶，用DEAE-葡聚糖凝胶为载体通过离子键结合法制成固定化酶，将L-乙酰氨基酸水解生成L-氨基酸，用来拆分DL-乙酰氨基酸，连续生产L-氨基酸。剩余的D-乙酰氨基酸经过消旋化，生成DL-乙酰氨基酸．再进行拆分。生产成本仅为用游离酶生产成本的60％左右。14固定化酶法生产L-氨基酸乙酰-DL－Ala

L－Ala+乙酰-D－AlaAminoacylase氨基酰化酶15泵储罐反应产物离心机消旋反应器固定化酶柱子DEAE-葡聚糖－氨基酰化酶晶体L-AlaL-AlaA-D-AlaA-L-AlaA-D-Ala16(2)天门冬氨酸酶：1973年日本用聚丙烯酰胺凝胶为载体，将具有高活力天门冬氨酸酶的大肠杆菌菌体包埋制成固定化天门冬氨酸酶，用于工业化生产，将延胡索酸转化生产L-天门冬氨酸。1978年以后，改用角叉菜胶为载体制备固定化酶，也可将天门冬氨酸酶从大肠杆菌细胞中提取分离出来，再用离子键结合法制成固定化酶，用于工业化生产。17(3)天门冬氨酸脱羧酶：将含天门冬氨酸脱羧酶的假单胞菌菌体，用凝胶包埋法制成固定化天门冬氨酸脱羧酶，于1982年用于工业化生产，催化L-天门冬氨酸脱去羧基，生产L-丙氨酸。18(4)青霉素酰化酶：是在药物生产中广泛应用的一种固定化酶。可用多种方法固定化。1973年已用于工业化生产，用于制造各种半合成青霉素和头孢菌素。用同一种固定化青霉素酰化酶，只要改变pH等条件，就既可以催化青霉素或头孢菌素水解生成6一氨基青霉烷酸(6一APA)或7一氨基头孢霉烷酸(7一ACA)，也可以催化6一APA或7一ACA与其他的羧酸衍生物进行反应，以合成新的具有不同侧链基团的青霉素或头孢霉素。19固定化细胞法生产6-氨基青霉烷酸青霉素酰化酶与抗生素改造202122E.Coli斜面细胞固定化细胞青霉素G转化液