本科开题报告

四川农业大学本科生毕业论文（设计）开题报告毕业论文（设计）题目青花椒DNA提取方法的研究姓名年级2008级学号开题报告（立题依据、研究的主要内容及预期目标、研究方案、论文进度安排、主要参考文献）1研究背景及意义1.1青花椒的简介青花椒（ZanthoxylumschinifoliumSieb.etZucc）又名香椒子、崖椒、椒、青椒、狗椒，因其果实成熟后为青色而得名。它属于芸香科、花椒属落叶植物，阳性树种［1］,属双子叶主根系植物,但侧根、须根多而发达,是著名的香料、油料树种。它不仅具有汉源贡椒的'纯正麻味”，而且还别具“麻味浓烈”、“气味清香”的特色，其果皮所具有的独特颜色和突出品质，使之深受消费者喜爱。青花椒在我国大部分地区都有分布,随着在各地菜肴尤其是川菜中的广泛使用，原来野生或半野生的青花椒已经在四川、重庆、昆明、贵州、湖南等地大量种植。青花椒是《中华人民共和国药典》所收载的常用中药材，具有温中止痛，杀虫止痒的功能,可用于脘腹冷痛、呕吐泄泻、虫积腹痛、湿疹瘙痒等症状的治疗［2］。其树杆材质细腻，可制作手柄、刀柄、木椅、烟斗等工艺家具品。由于青花椒根系发达，固土能力强，因此发展青花椒还可保持水土、绿化环境。1.2青花椒的发展现状1.2DNA的研究意义随着分子生物学手段的发展，利用分子标记及对青花椒植物叶绿体非编码序列扩增来研究其系统发育及遗传结构的方法逐渐兴起［4］。对其自然居群遗传多样性以及种群分化的研究，可以为进一步保护和利用青花椒，提供进化分子遗传学依据［5］。提取高质量的基因组DNA,是有效开展分子生物学研究的前提，保证试验结果的重复性［6］。PCR分析用的模板DNA纯度要求很高，但由于青花椒的叶片组织细胞内酚类化合物和多糖类物质等次生代谢产物较多，故提取高质量的基因组DNA难度较大［7-9］。利用改进的CTAB法（十六烷基三甲基漠化铵）和SDS法（十二烷基硫酸钠）分别对青花椒3种植物，即三叶青花椒、五叶青花椒、九叶青花椒的叶片进行总DNA的提取，以期获得纯度高、完整性好的总DNA［15］。1.3计项目（课题）研究的国内外现状（五号宋体加粗，段前0.5行）以Pricklyash为目标词应用OVID（世界三大农业文献数据库）-AGRICOLA,AGRIS,ERIC数据库进行摘要的检索，总共有409篇文章。以Pricklyash和DNA为关键词检索共有6篇，以pricklyashDNAextractionmethodofresearch和Greenpricklyash检索无任何报道。在中文文献数据库以花椒、DNA为检索词未查到任何文章，更不用说青花椒的DNA提取方法的研究。以植物DNA提取方法的研究（1979-2011）检索共有7篇文献，其中以蕨类植物DNA提取方法的研究（CTAB法、改良CTAB法、微量CTAB法、）和火龙果DNA提取方法的研究（CTAB法、改良CTAB法、SDS法、高盐法、快速提取法）最为具体，通过电泳检测、吸光值A260mm/A280mm比值的大小来分析提取的DNA的浓度和纯度，从而得出适合该植物DNA提取的方法，并为分子标记做好铺垫。2研究的主要内容及预期目标（小四宋体加粗，段前1行）2.1设计项目（课题）研究的主要内容（五号宋体加粗，段前0・5行）（1） 3个品种的青花椒对同一种方法的差异（2） 比较两种DNA提取方法的优缺点（3） 通过比较DNA的吸光度的范围，得出较优的DNA提取方法（4） 通过实验数据，分析影响DNA提取的主要因子2.2设计项目（课题）研究的预期目标（五号宋体加粗，段前0.5行）青花椒含有非常丰富的营养成分和矿质元素，因而难以提取高质量的DNA[10]。试验以青花椒叶片为材料，进行多种DNA提取方法比较研究，并通过琼脂糖凝胶电泳对所提取的DNA样品进行检测，通过比较吸光度的值，找出较优的DNA提取方法，来满足后续分子生物学研究的要求[11]。3研究方案（小四宋体加粗，段前1行）3.1设计项目（课题）的研究方法（五号宋体加粗，段前0.5行）3.11材料与方法3.111实验材料试验材料均于2004年5月采自天然林，掌叶木采于广西百色市老山林场，伊桐和东京桐采于广西木论自然保护区，肥牛树采于广西天等县。供试样品均为嫩叶，用硅胶快速干燥。3.112主要试剂高盐溶液:5moloLNaCl;1%B2巯基乙醇；115%PVP（聚乙烯基毗咯烷酮）40000。提取缓冲液A:200mmoloLTris2HClpH值810;250mmoloLNaCl;50mmoloLEDTA（乙二胺四乙酸）;115%PVP40000;1%B2巯基乙醇。提取缓冲液B:100mmoloLTris2HClpH值810;20mmoloLEDTA;114moloLNaCl;2%CTAB（十六烷基三甲基漠化胺）。提取缓冲液C:100mmoloLTris2HClpH值810;25mmoloLEDTA;115moloLNaCl;3%CTAB。011xTE:10mmoloLTris2HClpH值810;1mmoloLEDTA。高盐TE:1moloLNaCl;10mmoloLTris2HClpH值810;1mmoloLEDTA。3.113方法取嫩叶，与液氮共研磨成粉末，采用2种不同方法提取DNA。所得的DNA提取物用1%的琼脂糖凝胶电泳，进行DNA检测，然后在紫外凝胶成像系统下观察、成像。在紫外可见分光光度计上，测定稀释后的DNA样品溶液在260nm和280nm波长下的吸收值。根据A260/A280判断DNA的纯度，并计算OD值，调整所有DNA的量至200〜500mg・L-1[12]。（1）改良的SDS法[13][14]取0.5g硅胶干燥叶片，用去离子水洗净,在液氮中研磨10min,分装3管。加入800gl的SDS提取液（临用前加入2皿阳巯基乙醇,20%的PVP100gl），轻轻振动，65°。条件下水浴30min;加入90gl5mol/L的KAc，-20°。条件下冰浴30min;4°C、10000r/min离M15min;取上清液，加入等体积氯仿/异戊醇（V:V=24:1），轻轻振动;4C，10000r/min离心15min;取上清液,加入等体积异丙醇，轻轻振动几下，室温静置30min,12000r/min离心10min,取沉淀加入预冷的75%乙醇洗涤干燥;沉淀用500glTE溶解，静置5min,加入等体积氯仿/异戊醇（V:V=24：1），轻轻振动

几下，静置10min;4°C12000r/min离心10min;取上清液，加入川1RNAase轻轻振动,混匀，37丁条件下保温1孔加入600g1氯仿/异戊醇（V:V=24：1），轻轻振动;4C,12000r/min离心10min;取上清液，加入2.5mol/L的醋酸铵60gl,加入2倍体积的无水乙醇，室温静置30min,12000r/min离心10min;去除上清，沉淀干燥后，用30g1TE在37C水浴溶解DNA,RNAase消化RNA。用紫外分光光度检测DNA样品的浓度和纯度。最后样品DNA稀释至50ng/g1,作为PCR反应的模板。（2）改良。丁人：8-氯仿-异戊醇法1） 称取青花椒叶片1.08，加入0.1gPVPP于冰冷的研钵中用液氮研磨成细粉，装入10mL灭菌的离心管中。2） 迅速加入65C预热的CTAB提取缓冲液（50mmol/LTris-HCl；20mmol/LEDTA；1.4mol/LNaCl；2%CTAB，临时前加入2%0-巯基乙醇）4mL,混匀，在65。水浴中温浴裂解45min,期间不断摇匀，每隔10min摇动1次。3） 4C下12000g离心20min。4） 将上清液转入到洁净的灭菌离心管中，加入等体积氯仿-异戊醇（24:1）抽提，将其上下颠倒混匀，4C12000甘离心10min，取上清液。5） 将上清液小心转移到新的离心管中，加入2/3体积的-20C预冷的异丙醇，轻轻摇动，使其充分混匀，置于-20CT30min。6） 4CT13000g离心10min，弃上清液，可见絮状沉淀，即为DNA沉淀，用牙签挑出，装入0.5mL离心管。7） 用75%乙醇洗2遍，吹干，加入100gLTEBuffer（10mmol/LTris-HCl，pH8.0；10mmol/LEDTA，3.14通过查找文献。3.2设计项目（课题）研究的预期成果（五号宋体加粗，段前0.5行）（1）不同方法提取的DNA吸光值检测提取方法样品编DNA颜A260mmA280mmA260mm/A280mm号色状态改良CTAB法SDS法（2）不同方法提取DNA的电泳检测提取方法样品编号1样品编号2样品编号3改良CTABSDS法4设计项目（论文）进度安排（小四宋体加粗，段前1行）2011年2011年3月〜2011年4月2011年4月〜2011年5月2011年5月〜2012年6月第二阶段可根据具体情况详细化毕业设计（论文）撰写毕业设计（论文）答辩5主要参考文献(小四宋体加粗，段前1行)陈炳金，王明钊,张洪渊，等1调味料栽培与加工技术[M]成都:四川科学技术出版社,1997:10221031⑵人民共和国卫生部药典委员会1中华人民共和国药典[M]广州:广东科技出版社,19951福建农业职业技术学院，福州350119；2福建农林大学园艺学院，福州350002:2009-1749王艇,苏应娟，郑博，等.中国桫楞科植物叶绿体n以内含子和trnL2trnF基因间隔区序列的系统发育分析[J].热带亚热带植物学报,2003,11(2):137-142.周志琼，苏智先,廖永梅，等.桫楞的生物学研究进展[J].贵州师范大学学报:自然学版，2004,22⑶：100-103.XZAQ.TheclassificationoftheChineseCyatheaceae[J].ActaPhyotaxo2nomicaSinica,1989,27⑴：1-16.王艇，苏应娟,李雪雁，等.孑遗植物桫楞种群遗传变异的RAPD分析[J].生态学报,2003,23(6):1200-1205.王经源，黄儒珠.刺桫楞DNA的简便快速提取方法[J].福建林学院学报,2001,21(4):376-379.徐艳,刘燕,石雷.大叶黑桫楞抱子超低温保存[J].植物生理学通讯,2006,42(1):55-57.邓洪平，徐洁，陈锋，宋琴芝(西南大学生命科学学院三峡库区植物生态与资源实验室，重庆400715)西北植物学报,2008,28(10):2103-2109侯义龙，曹同，蔡丽娜，孙志刚，崔琳，苔藓植物DNA提取方法研究广西植物Guihaia23(5):425-428利希成、雷勃钧、卢翠华、钱华、吕云波，高效的植物提取方法，生物技术4(3)：39-41,1994王玲玲，叶青雷，王学英,石生林，李群，尹迎礼，栋属植物DNA提