木瓜蛋白酶活力的测定

蛋白酶的活力用分解出来的酪氨酸来表示。目前国内通用的蛋白酶的活力单位定义为:1min水解出1g酪氨酸的酶量称为1个单位。因此，在测定酶活力之前，先用福林酚试剂与已知的不同浓度的酪氨酸反应，作出蓝色深浅程度（用0D值来表示）与酪氨酸浓度关系的标准曲线，然后将酶和底物反应的产物与福林酚试剂作用，在分光光度计上读出光密度，再在标准曲线上推算出相当于多少g的酪氨酸，计算出酶活力单位木瓜蛋白酶是天然复合蛋白酶，通常，测定其酶活力时间长，操作复杂，且需要玛瑙研钵等昂贵仪器。由于木瓜蛋白酶中的各种酶与酪蛋白作用生成的产物是一致的，即酶催化蛋白质的肽键水解，生成游离的氨基酸或多肽。因此可以利用福林酚试剂与水解出来的酪氨酸作用，生成蓝色物质，通过分光光度比色法可以计算出酶活力的大小（1） 福林酚试剂：称取钨酸钠（Na2wo4・2H20）25g、钼酸钠Na2MnO4•2H20）25g放入2000m1圆底烧瓶中，加入175ml蒸馏水，再加入50ml85%的磷酸及100ml浓盐酸。装好回流冷凝管（接口处包有铝薄或玻璃纸的软木塞），加热到沸腾，然后用/1、火保持缓和的沸腾状态，回流10h，回流结束后加入150g硫酸锂Li2SO4和50ml水，并在沸腾（不必装冷凝管）时立即加入几滴漠液（应趁热加漠，否则没有充分作用就挥发完了），待作用数分钟后再煮沸15min以除去过量的漠。加漠的作用是除掉溶液中的绿色。如果溶液仍呈绿色，可再加入几滴漠液，再煮沸除去多余的漠直至试剂呈黄色。冷却后稀释至1000ml（原液），过滤，贮于棕色瓶，f临用前将此原液加入2倍蒸馏水稀释而成。（2） 标准酪氨酸溶液称取100mg酪氨酸（预先在105°C烘箱内烘至匣重），以0.2NHC1溶解后定容到100ml再用水稀释5倍，即得到2001,zg/L的酪氨酸溶液.（3） 酪蛋白溶液称取酪蛋白2g，置于100ml三角瓶中，加入0.2mol/LNazHPO61ml置水浴上搅动使其溶解，然后倾出上清液（可能有少量蛋白质颗粒不能完全溶解），加入39ml0.2mol/LNaH2PO，得到pH7.0的酪蛋白溶液，其余几种pH的酪蛋白液可照此法制备，pH5.8酪蛋白液用H3PO调节，pH8.5酪蛋白液可全部用Na2HPO配制，再用NaOH调节至8.5。表1是不同pH的缓冲液配制表。

表1不同pH的缓冲液配制表PH6.57.07.55.80.2mol/LNaH2PO468.5ml39ml16ml92ml0.2mol/LNa2l1PO43L5ml61mlK4ml8nil酶溶液：称取1.Og酶粉加入500mlpH7.0的缓冲液中，在室温中放置lh,搅拌。把酶浸出液过滤，取滤液lml用缓冲液稀释至100ml,即为稀释5x104倍的酶液。做pH影响的试验中，酶液应该用所需的pH缓冲液稀释。O.4mol/LNa2CO3O.4mol/L三氯醋酸(TCA)1.2实验方法1.2.1酪氨酸标准曲线制作取6支小试管按表2加入酪氨酸及蒸馏水，得到一系列不同浓度的酪氨酸溶液表2 不同浓度酪氨酸溶液配制表管号标准酪氮酸(200|xg/mg)加入量(ml)IbO加入量(ml)酪氮酸最终浓度(|Ag/ml)105.0020+54.5203LO4.04041.53.56052.03.08。62.52.5100将不同浓度酪氨酸溶液吸取lml于6支试管中。按表3次序逐个加入试剂，并混合均匀，然后置于40〜C恒温水浴中保温20rain,在721型分光光度计上读取光密度(取680nm)。表3 不同浓度酷氨酸溶液对应光密度表管号酪氨酸量3g)0,4iik>1/LGnl)福林酚试剂(ml)680nm下OD值105102如510.215340510.48()4605J0.660580510.8606100511.15()以表3酪氨酸浓度为横座标，光密度为纵座标，绘制酪氨酸标准曲线。1.2.2蛋白酶活力测定蛋白酶活力测定的操作包括：a酶和底物混合保温；b停止酶的作用；c过滤；d显色等4个步骤。⑴取4支试管，每管中加入酶液lml第一管作为对照(在同样条件下，由于酶以外的种种因素所引起的变化，例如底物、试剂等本身所产生的颜色称为空白，在此色时用管调节分光光度计的光密度为o’，使其它3管在分光光度计上读得的光密度值，直接代表酶的活力)。加入o.4mol/LTCA2ml使酶在没有遇到底物时已经失去活性。在另外3支试管内加入lml酪蛋溶液(pH7)，将4支试管同时放人40%z〜浴准确保温10min向第2、3、4管内加入2ml0.4mol/LTCA，停止酶作用，对照管内加入lml酪蛋白溶液，在40〜C7J〜中保温10min,使蛋白质沉淀完全。过滤，除去沉淀的酶蛋白和酪蛋白。从每一管中取滤液lml分别注入4支试管中，然后各加入0.4mol/LNaCO5ml、福林酚试剂lml，在40qEA~浴保温20min显色，在分光光度计

Az用680nm读取光密度（表4）。1.2.3酶活力任算将酶活力测定中所得DD值在标准曲线上查得酪氨酸微克数，按下式H-曾号隘液gift赍白H-曾号隘液gift赍白40^fl/4tr>41TCA£唯骼旌白AMam愤渔OAwl/IAHiCU,福林耻£利4jOY：uaaTEM位ImlIcnl2ro]IralZrnlImlImJE5nilImlTriJ03203ImlImDInJInd2ia12mJ,IfJirjinIiitlInd(P.31I4算景4at白酪商力剃定时加研濯曜，TCA・、NhXX虹毋、福林酚诚刑■及68»iun下的茹值在生产和科研工作中常常需要测定酶活力，可在标准曲线制作好了以后，求出k值，再按下式计算：木瓜蛋白酶活力单位=OD•K•4/10•N式中：DD一光密度读数，计算时可用平均值K一光密度为1时酪氨酸微克数即在酪氨酸标准曲线上取1O0b〜g的D.D值，用100除以OD值，即得K值。本次试验标准曲线上相当于1O01〜g酪氨酸的OD为1.15，