真菌感染与实验室诊断进展- 李若瑜

全国基层医疗机构抗菌药物合理应用2021/5/9常见病原真菌李若瑜北京大学第一医院北京大学真菌和真菌病研究中心2021/5/9真菌感染的分类——根据真菌侵犯人体的部位分为四类：浅表真菌病皮肤真菌病皮下组织真菌病系统性真菌病浅部真菌病深部真菌病2021/5/9临床常见的真菌病——浅表真菌病：花斑癣掌黑癣毛结节菌病皮肤真菌病：皮肤癣菌病

—手足、体股、头、甲皮肤念珠菌病皮下真菌病：孢子丝菌病着色芽生菌病暗色丝孢霉病足菌肿系统性真菌病：念珠菌病曲霉病隐球菌病接合菌病双相真菌感染2021/5/9浅部真菌病限于皮肤最外层，甲板、毛发和粘膜的感染。主要的感染是皮肤癣菌病和浅表念珠菌病。大多轻微，容易诊断，对治疗反应良好。2021/5/9手、足、甲癣—最常见的真菌病2021/5/9各种头癣：传染、危害健康2021/5/9皮下真菌病—往往经过外伤发病孢子丝菌病着色芽生菌病2021/5/9

系统性真菌病

常起源于肺，可以播散到全身许多器官。常通过吸入致病菌孢子而获得，其致病菌腐生于土壤或腐败有机物中，或作为植物致病菌。病原体可分为两组：真正的致病菌和条件致病菌。2021/5/9系统性真菌病—危及生命2021/5/9系统性真菌病主要的致病真菌荚膜组织胞浆菌粗球孢子菌皮炎芽生菌巴西副球孢子菌2021/5/9临床常见的条件性真菌感染念珠菌病:最常见，血源感染的第4位。曲霉菌病:常见于干细胞移植、实体器官移植、大剂量化疗患者。隐球菌病:艾滋病人患病率为10-20%。接合菌病（毛霉病）:多见于重症糖尿病、烧伤病及器官移植病人。2021/5/9临床有增多趋势的条件性真菌非白念念珠菌感染毛孢子菌感染地霉感染镰刀菌感染枝顶孢霉感染暗色真菌感染马尔尼菲青霉2021/5/9真菌感染的诊断方法真菌镜检真菌培养组织病理生理生化血清学方法分子生物学2021/5/9真菌感染的实验诊断方法及问题显微镜检查-阳性率？培养-时间？敏感性？意义？血清学-敏感性？特异性？分子生物学-标准化？2021/5/9组织病理学2021/5/9阿申蓝染色H&EPAS组织学特点Immunochemistry皮肤隐球菌病的组织病理学2021/5/9

菌丝孢子曲霉病的组织病理学Prof.RicharddCalderone’slecture-2006,Beijing2021/5/9念珠菌病-直接镜检2021/5/9隐球菌病—直接镜检2021/5/9

曲霉病——曲霉头曲霉病双分支菌丝2021/5/9曲霉病——直接镜检双分支菌丝曲霉头2021/5/9

接合菌（毛霉）病—直接镜检粗大无分隔菌丝2021/5/9各种培养法—2021/5/9病原真菌鉴定的基本流程临床标本PDA,SDA28度培养不能生长鼻孢子菌、肺孢子菌、马拉色菌（厚皮除外）芽孢关节孢子念珠菌、隐球菌、红酵母等毛孢子菌、地霉等有隔菌丝无隔菌丝担子菌、子囊菌、半知菌接合菌等2021/5/9常见病原真菌酵母及酵母样真菌_念珠菌_隐球菌_毛孢子菌_马拉色菌霉菌(丝状真菌)_皮肤癣菌_曲霉_毛霉_镰刀菌等双相真菌2021/5/9念珠菌属2021/5/9简介念珠菌大约有150个种，65%以上不能在37℃生长，无致病性念珠菌属可以感染皮肤、粘膜及内脏器官引起念珠菌病常见的致病性念珠菌白念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、季也蒙念珠菌、乳酒念珠菌临床最常见的是白念珠菌2021/5/9生物学特性

念珠菌在环境中和人体内均可寄生存在

正常人皮肤、口腔、肠道、肛门、阴道中可分离出本菌

显微镜下表现为芽孢和假菌丝假菌丝一般与致病相关寄生时一般表现为孢子相

2021/5/9致病性

条件致病菌

白念珠菌致病力强

念珠菌毒素、菌体形态、黏附性和分泌水解酶与其致病性密切相关2021/5/9常见病原菌白念珠菌（Candidaalbicans）热带念珠菌（C.tropicalis）克柔念珠菌（C.krusei）近平滑念珠菌（C.parapsilosis)光滑念珠菌(C.glabrata)乳酒念珠菌（C.kefyr）季也蒙念珠菌（C.guilliermondii）2021/5/9实验室检查直接镜检：可见卵园形发芽孢子及菌丝，如查到大量假菌丝，说明念珠菌处于致病状态。染色：革兰氏染色，菌丝、芽孢呈蓝色，着色不均匀。过碘酸染色，菌丝、芽孢染成红色。用1:1000吖啶橙染色，在荧光显微镜下，菌体呈现荧光。培养：最常用的培养基是沙堡氏培基，当菌落生长后再移种至米粉吐温80培基或其它鉴定培养基中，以便进一步鉴定菌种。2021/5/9念珠菌直接镜检（LPCB）假菌丝和芽孢2021/5/9致病性酵母菌鉴定原则

鉴定目的：确定感染及传染源；选择敏感抗真菌药物；哪些酵母菌需要鉴定到种：所有分离自无菌体液，包括脑脊液、血液、尿液、穿刺液及其它体液的酵母菌；分离自所有严重疾患或免疫受损病人或怀疑真菌感染的病人的酵母菌；从任何临床标本中分离出大量的酵母菌；分自若干连续取材的标本，除呼吸道分泌物，也应鉴定至种的水平；2021/5/9芽管试验（Germ-tubetest）原理：白念珠菌在有营养的液体环境中35℃培养，可从酵母细胞生出芽管。结果：白念珠菌可在2h内生成芽管，热带念珠菌和其他念珠菌则否。2021/5/9

厚膜孢子形成试验

（Dalmoplatetest）2021/5/9念珠菌显色培养基

CHROMagarCandida2021/5/9API—20C酵母鉴定系统2021/5/9ID32C酵母鉴定系统2021/5/9VITEK全自动微生物鉴定仪YBC酵母菌鉴定卡。有30个孔的一次性塑料卡，包括26个常规生化反应和4个阴性质控。利用YBC，只有21.3%的酵母需做补充生化试验或形态学检查。2021/5/9白念珠菌

菌落特征沙氏培养基25℃中等速度生长，形成酵母样菌落，奶油样、光滑、闪光，老后有皱褶显色琼脂基上呈绿色菌落

显微镜特征玉米粉吐温琼脂：真菌丝和假菌丝，多数假菌丝，假菌丝连接处产生多数呈簇状、葡萄状小分生孢子，顶端或侧支产生厚壁孢子血清芽管试验，在37℃1-3小时后，可以产生芽管2021/5/9白念珠菌

(Candidaalbicans)2021/5/9酵母菌鉴定程序和路线

酵母纯培养

玉米粉吐温琼脂培养基(25℃)‘

假菌丝（+）假菌丝（-）

厚壁孢子（+）厚壁孢子（-）尿素酶试验（+）尿素酶试验（-）白念珠菌光滑念珠菌关节孢子（+）关节孢子（-）酵母属芽孢（+）菌落无胡萝卜色菌落呈胡萝卜色芽孢（+）芽孢（-）念珠菌属红酵母属丝孢酵母属地霉菌属咖啡酸试验

有棕色色素无棕色色素新生隐球菌隐球菌属2021/5/9血清学试验-菌种鉴定抗原型别：

—因子血清（CANDIDACHECK）：九种因子+蔗糖分解，鉴别7种致病性念珠菌；

—因子血清（CRYPTOCHECK）：八种因子，可鉴别8种隐球菌及变种2021/5/9分子生物学方法C.glabrata,C.lusitaniaeC.gulliiermondii,C.kefyrC.tropicalis,C.krusei,C.parapsilosisC.albicansC.dubliniensisC.albicans&C.dubliniensisRAPDmethodotherfiveCandidaspp.RFLPwithMspInineCandidaspp.PCRinITSregion1.5hrs3hrs2.5hrs4.5hrs5.5hrs2021/5/9小结—酵母菌鉴定依据传统菌落颜色、外观镜下细胞形态、大小有无荚膜有无假菌丝和菌丝芽管形成和厚膜孢子形成碳源同化、发酵氮源同化、发酵现代辅酶Q系统同功酶血清学基因分型技术2021/5/9敏感药物与耐药性两性霉素B唑类抗真菌药物(除光滑和克柔念珠菌外,大多数对氟康唑敏感.长期用药有可能出现耐药)棘白菌素类药物

2021/5/9隐球菌

2021/5/9隐球菌属

(Cryptococcus)特点本属的共同特征为细胞呈圆形或卵圆形，偶有伸长形或多样形，呈多边芽殖。大部分菌株有荚膜。所有菌种都能同化肌醇并在碳源中生长。糖发酵（—）在固体培养基中，大部分菌种呈粘液状，无假菌丝或假菌丝发育不全。不产生子囊孢子。冬孢子或掷孢子。新生隐球菌有性期：属担子菌，新生线黑粉菌2021/5/9临床常见的隐球菌Lodder1970年记载隐球菌：17种，6变种。主要致病菌种：新生隐球菌新生隐球菌新生变种新生隐球菌格替变种C.neoformansvar.grubii浅黄隐球菌浅白隐球菌罗伦隐球菌2021/5/9致病性隐球菌新生隐球菌(C.neoformans)三个变种新生隐球菌新生变种（C.neoformansvar.neoformans）格特变种（C.neoformansvar.gatii）C.neoformansvar.grubii

2021/5/9血清学分类A、B、C、D及AD型新生变种-D型grubii变种-A型格特变种-B、C型2021/5/9致病性

呼吸道进入体内健康人具有免疫能力

易感因素AIDS、糖尿病、淋巴瘤、晚期肿瘤、SLE、器官移植

2021/5/9隐球菌病cryptococcosis是由隐球菌属中某些种或变种引起的一种深部真菌病。主要侵犯中枢神经系统,预后严重,死亡率高,也可侵犯肺部、皮肤、骨骼等其它脏器。近年来免疫力降低的病人逐年增多,本病发病率也呈上升趋势,特别是在爱滋病病人已成为死亡的主要原因之一。2021/5/92021/5/9生物学性状

在SDA培养基上25℃培养2-5天，可以见到奶油色酵母样菌落，有时黄色或带粉色显微镜下可见到球形或椭圆形酵母细胞，直径2-5μm，第一代培养物有时可见小的荚膜，继代培养不见荚膜脑脊液直接涂片，细胞有较宽的荚膜。显微镜下有时可见到出芽现象2021/5/9实验室检查-病原学检查直接镜检:墨汁染色，新生隐球菌呈圆形或椭圆形的双层厚壁孢子,外有一层宽阔荚膜,边缘清楚完整,菌体内可见出芽（菌体计数：判断预后及疗效的指标）培养：培养基内可加氯霉素,但不可加放线菌酮,因后者抑制本菌生长。生理生化测定：采用自动微生物系统和API鉴定组织病理学检查及免疫组化

2021/5/9直接镜检

脑脊液直接墨汁涂片2021/5/9真菌培养

SDA培养基，25℃培养

2021/5/9实验室检查-其它检查方法脑脊液检查：中枢神经系统隐球菌病脑脊液压力增高,外观正常或微混,白细胞数增多,早期以中性粒细胞为主,中后期以淋巴细胞为主。糖和氯化物在早期变化不明显,中后期可明显减少。蛋白含量在中后期增高。抗原检查：乳胶凝集试验检测脑脊液及其它体液标本中新生隐球菌荚膜多糖抗原可简便快速有效诊断隐球菌性脑膜炎2021/5/9乳胶凝集试验

阴性阳性2021/5/9新生隐球菌

(Cryptococcusneoformans)主要侵犯中枢神经系统，也可侵及肺、骨、皮肤，甚至引起败血症。肺是新生隐球菌侵入的主要途径，肺隐球菌病也是隐球菌病的最早表现。该菌的特异性检查为，墨汁涂片，镜下可见圆形或卵圆形厚壁孢子，直径2.5-20um，单芽，也可多芽。菌体外围有一圈透光的荚膜，厚度几乎与菌体相等甚至大于菌体。孢子内有反光颗粒。尿素酶试验阳性。2021/5/9新生隐球菌

(Cryptococcusneoformans)

直接镜检（墨汁染色）咖啡酸琼脂产生棕色菌落2021/5/9敏感药物两性霉素B5-氟胞嘧啶(与两性霉素B联合用药)氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑等唑类药物多用于维持治疗或两性霉素B不耐受的病例。2021/5/9曲霉2021/5/9菌属分类曲霉是一类丝状真菌，在自然界中广泛存在。曲霉属的有性阶段属于子囊菌门、不整子囊菌纲、散囊菌目、散囊菌科、散囊菌属、裸孢壳属和萨托菌属；有性期仅在部分曲霉有描述。无性阶段属半知菌、丝孢纲、丝孢目、从梗孢科。2021/5/9菌属分类烟曲霉（A.fumigatus）是最常见的致病曲霉其次为黄曲霉（A.flavus）和黑曲霉（A.niger）棒曲霉（A.clavatus）、灰绿曲霉（A.glaucus）、构巢曲霉（A.nidulans）、米曲霉（A.oryzae）、土曲霉（A.terreus）、焦曲霉（A.ustus）、杂色曲霉（A.versicolor）也有致病报道，但发生率低。2021/5/9致病性曲霉引起的人类疾病可分为3大类：机会性感染变态反应性曲霉病真菌中毒免疫受损是曲霉机会性感染的最主要因素。2021/5/9曲霉的菌落形态曲霉菌落呈绒毛状或粉状。大多数曲霉的培养基背面无色或淡黄色。构巢曲霉培养基背面可以呈紫红色、橄榄色；杂色曲霉背面则可呈桔黄色、紫红色。2021/5/9三种最常见人类致病性曲霉菌落形态烟曲霉黄曲霉黑曲霉2021/5/9曲霉的主要形态特征菌丝----分隔、分枝、无色/淡色/深色足细胞----有分生孢子梗----分隔/不分隔,光滑/不光滑顶囊----烧瓶/半球产孢结构—瓶梗/瓶梗+梗基分生孢子—大小、颜色、纹饰其它:子囊果、菌核等2021/5/92021/5/9曲霉的特殊结构曲霉的特殊结构包括：闭囊壳（cleistothecia）壳细胞（Hullecells）粉孢子（aleuriconidia）菌核（sclerotia）2021/5/9烟曲霉黄曲霉黑曲霉三种最常见人类致病性曲霉镜下形态2021/5/9敏感药物与耐药性可选用两性霉素B、伏立康唑、伊曲康唑、卡泊芬净和米卡芬净。近年来，耐伊曲康唑的烟曲霉报道增多，而且出现多药耐药的烟曲霉临床分离株。对两性霉素B耐药的黄曲霉临床分离株也有报道。土曲霉对两性霉素B天然耐药。构巢曲霉对两性霉素B也常常耐药。2021/5/9接合菌(Zygomycetes)2021/5/9生物学特性及致病性接合菌的主要特征为无性型在孢子囊内形成不能游动的静孢子，有性型形成接合孢子接合菌纲中只有毛霉目和虫霉目两个目的部分种可以致病。由毛霉目的菌引起的病称毛霉病（Mucormycosis），毛霉目和虫霉目引起的病合称为接合菌病。2021/5/9毛霉目的分类位置

真菌界(funguskingdom)

接合菌门(zygomycota)

接合菌纲(zygomycetes)

毛霉目(mucorales)

犁头霉属、根霉属、根毛霉属、毛霉属2021/5/9与医学关系在毛霉目中已知可引起毛霉病有8科12属24种左右由毛霉目的菌引起的病称毛霉病，由毛霉目和虫霉目引起的病称接合菌病，亦称藻状菌病2021/5/9毛霉病(mucormycosis)概述是由毛霉目中某些菌种引起人类的一种感染性疾病,一般呈急性快速发展,少数为慢性发展。可累及鼻、脑、肺、胃肠道、皮肤等器官，其共同特征是血管壁破坏，血栓形成，周围组织梗塞，产生黑色坏死性损害。大部分病人有严重的基础疾病,如糖尿病、免疫抑制、饥饿、烧伤或其它严重的外伤。2021/5/9诊断较困难,特别是内部器官感染,常常是在尸检中发现。毛霉为空气的污染菌,血、尿、脑脊液中罕见病原体生长,血清学试验和直接ELISA试验缺乏特异性,常规化验更无意义,因此诊断困难。直接镜检标本中和组织病理切片中见到宽大无分隔或极少分隔菌丝,比培养分离更有意义。真菌镜检阴性,不能除外诊断。糖尿病患者,有急性快速播散的鼻窦炎、眶组织蜂窝织炎、支气管炎、支气管或叶的肺炎,应考虑毛霉病的诊断。2021/5/9组织病理2021/5/9直接镜检可见粗大的、无分隔的、不规则、宽约3-18um、分枝较少且呈直角的菌丝在HE染色清晰,PAS和GMS染色不良发现菌丝是诊断的基础2021/5/9真菌培养毛霉目中的致病菌在许多真菌培养基上快速生长对放线菌酮敏感，故培养基内不用此药，可加抗生素抑制细菌生长。活体标本不要研磨以免损坏菌丝，而妨碍生长。置于25℃～30℃培养，根据镜下特征鉴定菌种。用于毛霉鉴定的培养基主要是PDA和SMA（毛霉合成培养基）2021/5/9毛霉的结构特征2021/5/92021/5/9治疗原则积极控制基础病及早起初坏死组织及时应用两性霉素B或泊沙康唑还可选择伊曲康唑、特比萘芬2021/5/9双相型真菌Dimorphicfungi2021/5/9双相型真菌37°C–酵母相27°C–菌丝相2021/5/9定义专指那些在组织内或37℃培养时呈酵母相，于室温中培养时则呈菌丝相的致病真菌包括申克孢子丝菌、马内菲青霉、荚膜组织胞浆菌、粗球孢子菌、巴西副球孢子菌和皮炎芽生菌等有较严格的地域分布（仅申克孢子丝菌此点不突出）对人体致病力较强（有较大的侵袭性），患者不一定在感染前有免疫受损2021/5/9马内菲青霉

（Peniciliummarneffei）属于双相型真菌可引起马内菲青霉病（penicilliosismarneffei）主要流行区为东南亚，如泰国北部、越南、香港、台湾及中国的南方目前已成为HIV阳性患者的主要条件致病菌2021/5/9菌落特征在SDA上，25℃培养，生长快，初为白色膜样或绒状，逐渐变为黄色至黄绿色绒状，2周后呈灰绿色粉状，能产生可溶性酒红色色素，培养基呈红色在BHI上，37℃培养，呈脑回样皱褶的灰白色膜样酵母菌落，无色素产生2021/5/9菌落特征菌丝相酵母相2021/5/9显微镜特征--菌丝相帚状枝分散，双轮生，少数为单轮生，对称或不对称，有2～7个梗基，梗基上有3～6个瓶梗，顶端变窄，也可见单个瓶梗分生孢子呈椭圆形、球形，长而散乱，不成束2021/5/9显微镜特征—酵母相可见关节孢子，圆形、椭圆形及两端钝圆有横隔的长形酵母细胞2021/5/9荚膜组织胞浆菌

（Histoplasmacapsulatum）属于双相型真菌有两个变种，即荚膜组织胞浆菌荚膜变种（H.capsulatumvar.capsulatum）和荚膜组织胞浆菌杜波变种（H.capsulatumvar.duboisii）可引起组织胞浆菌病(histoplasmosis)在北美和拉丁美洲的一些特定区域流行

2021/5/9显微镜特征2021/5/9真菌感染的非培养诊断2021/5/9非培养诊断检测方法G试验检测b-1,3–D-葡聚糖ELISA法检测曲霉抗原乳胶凝集试验检测新生隐球菌抗原ELISA法检测念珠菌抗原PCR_真菌通用引物、种属特异性引物2021/5/9

方法：G试验β-葡聚糖可特异性激活鲎（Limulus）变形细胞裂解物中的G因子，引起裂解物凝固，故称G试验。-b-1,3-D-葡聚糖通过激活G因子（FactorG）引起凝集；内毒素通过激活C因子（FactorC）引起凝集；试剂盒:祛除FactorC葡聚糖特异2021/5/9β-1,3-D-葡聚糖

检测范围不仅可检测念珠菌感染曲霉、镰刀菌和很多霉菌均存在β-1,3葡聚糖(Miyazaki,JClinMicro33:3115,‘95)隐球菌细胞壁为alpha-葡聚糖,故为阴性阳性结果只能代表存在侵袭性真菌感染,不能确定种类假阳性:纱布，某些血液透析的滤过器等2021/5/9ClinInfectDis2004;39:199-205侵袭性真菌感染中葡聚糖检测AML,MDSReceivingantifungalprophylaxis2021/5/9Cutoff60pg/mlClinInfectDis2004;39:199-205.3030withcandidemiacontrolsubjects侵袭性真菌感染的葡聚糖检测Fungitellassay2021/5/9检测曲霉半乳甘露聚糖抗原的EIA方法（Platelia）检测位于曲霉细胞壁上的galactomannan,（GM）3.Detection–avidin-enzyme+substrate2.DetectingAb–anti-galactomannan[biotinconjugated]Ag–blood,urine,BAL1.Captureantibody–monoclonalanti-galactomannan

Specificity=>90%sensitivity=75%2021/5/9PlateliaAspergillusEIA–结果判断2021/5/9曲霉的GM

抗原检测乳胶凝集试验（Pastorex®）

(15ng/ml)酶连免疫吸附试验（Platelia®）(1ng/ml)灵敏度（%）特异度（%）LA25-7090-100ELISA50-9080-90Sabettaetal.JID1985;152:946Ansorgetal.EurJClinMicrobiolInfectDis1994;13:582Verweijetal.JCM1995;33:3150Maertensetal.Blood2001;97:1604Herbrechtetal.JClinOncol2002;20:18982021/5/9GM抗原2021/5/9GM抗原检测用于侵袭性曲霉病诊断与临床诊断和疗效反应有良好的一致性。检测方法有ELISA、放射免疫分析（RIA）和乳胶凝集试验等。Platelia试剂盒采用ELISA方法，敏感性~80%，特异性>80%。儿童假阳性10%。Cut-off值影响结果—0.5:早期诊断,特异性差;1.5:特异性提高。可动态观察。Dr.MaschmeyerG.in2ndTrendsinMedicalMycology,23-26October2005,Berlin2021/5/9曲霉感染检测的影响因素半乳甘露聚糖在血中存在时间短，建议：

—高危人群每周至少检测2次，动态观察

—结合影象学、培养结果综合分析诊断假阴性假阳性哌拉西林/他唑巴坦与其它细菌或真菌成分有交叉反应肠道中定植的曲霉释放GM进入血液循环含有谷物的食物中存在GM抗原，通过受损肠黏膜进入血循环导致抗原血症，化疗后出现严重黏膜炎的更易发生2021/5/9检测真菌DNA的PCR试验标本：全血血清活检组织BALCSF不同方法：•DNA提取

•PCR设计•产物检测2021/5/9PCRPCR技术用于诊断种特异-PCR非特异PCR杂交Standart"single""nested"PCR-EIA"Real-time"标本全血血浆血清BAL最低检测范围4-10cfu/ml25-100fgDNA原位杂交目的基因多拷贝基因2021/5/9PCR过筛试验诊断IA每周监测2次—通用引物;确定