cn3a一种酿酒酵母工程菌及其应用与饲料添加剂

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*CN (10)申请公布号 (43CGMCCNo.6921(71)申请人大北农科地址100080市海淀区中关村大街申请人科高大北农饲料公司浙江大北农农牧科技(72)发明人冯C12N1/19(2006.01)C12N15/12C12N15/81A23K1/16C12R1/865(2006.01) 权利要求书1页说明书5页序列表1页附图2页Acerevisiae程菌，其是将猪防御pBD2熟A 权利要求 1/1YS58pAUR123根据权利要求1pBD2成熟肽序列是指pBD2的26～69位氨基酸序列所述酿酒酵母信号肽序列是指克隆自酵母表达质粒pPICZαA的第941-1207位编码的89个氨基酸残基的酿酒酵母信号肽序列。26～69位氨基酸的序列，通过扩增引物在5’端导入KpnI酶切位点，3’端导入SacI酶切位点，用KpnI和SacI将扩增的pBD2双酶切后连接在酵母表达载体pAUR123的KpnI和SacI酶切位点上，构建得到pABD2质粒；通过PCR方法扩增酵母表达质粒pPICZαA的酿酒酵母信号肽序列的第941-1207位，并通过引物在序列两端引入KpnI酶pABD2KpnIPCRpABD2pABD2apABD2aYS58AbA抗性筛选得到具有抑一种酿酒酵母工程菌及其应用与饲料添加[0001]本发明属于微生物工程菌领域，涉及一种酿酒酵母工程菌及其应用与饲料添加[0004]pBD2 [0008]CGMCC[0009]pBD2DNA 图2pAUR123载体的酶切和猪防御素pBD2的扩（1.8%琼脂糖凝胶。1、MarkerII21kbplusDNAladder34pAUR123/KpnI+SacI56pBD2PCR扩增。 图3酵母重组载体pABD2插入的猪防御素的PCR鉴定电泳图（1.8%琼脂糖凝胶。1MarkerII23酵母重组质粒pABD2载体的PCR验证。 pPICZαII2[0017]图5酵母重组载体pABD2α插入的α-factor的PCR鉴定电泳图（1.8%琼脂糖凝胶。1MarkerII；2对照；34酵母重组载体pABD2a插入的a-factor的PCR空白对照2为酿酒酵母工YSBD58发酵上清对金黄色葡萄球菌的抑制作用。 根据猪防御pBD2序列设计上游引pBD2-FACACTTAGC-3在上游引物端引入酶切位点KpnI在下游引物5‘端引入终止子TTA和酶切位点SacI。用英骏公司合成的猪防御素pBD2多肽为模板进行PCR扩增。PCR9723分钟。PCR体系pBD2-F1μL，pBD2-R-N-21μL10×dNTP2μL,10×ExTaqBuffer2μL,ExTaq0.5μL20μL。PCR1.8%琼脂糖凝胶电泳的结果见图2，PCR产物用PCR纯化试剂（天根公司纯化纯化步骤详见试剂盒说明书。纯化产物送公司，结果用DNAman软件比对正确。 用KpnI和SacI酶切PCR纯化的产物，酶切体系为：PCR纯化产物20μL，25μLKpnI温育3小时。 25μLKpnI250μL31.8%2。[0025]猪防御素pBD2多肽的酶切产物和pAUR123的酶切产物用PCR纯化回收试剂pAUR123/Kpn3μL10×T41μLT4-2042905900μLLB培养基。37150rpm1200μL培养液涂布加入20μg/mLAp抗生素的平板，37养。挑取单菌落做菌落PCR，PCR体系和条件如上所述。PCR产物经1.8%琼脂糖凝胶电泳的结果见图3，PCR产物后与预期片段的同源性达到100%。将构建的重组酵母猪防御素pBD2表达载体命名为pABD2。[0028]酵母胞外表达质粒pABD2α的构建过程如图1所示。根据酵母胞外表达载端引入酶切KpnI。用100pPICZαA质粒作为模板。PCR扩增94℃预变1μL10×dNTP2μL,ExTaq0.5μL，加超纯水补充体系20μL。PCR扩增结果1.8%琼脂糖凝胶电泳纯化产物送公司，结果用DNAman软件比对正确。[0029KpnIPCRPCR20μL10×buffer25μL10×buffer25μLKpnI3μL水补充体系到250μL37℃温育3小时。酶切产物经1.8%琼脂糖凝胶电泳验证酶切效果。[0031]α信号肽和pABD2质粒的KpnI酶切产物用PCR纯化回收试剂盒回收。回收后3μL10×T1μLT4-10μL4℃JM10期片段的同源性达到100%。将构建的重组酵母胞外表达载体命名为pABD2α。[0033]用化学法将实施例2构建的重组酵母胞外表达载体pABD2α转化入酿酒酵母YS58转化方法过夜培养酿酒酵母YS58第二天1%接种量转接50mLYPD培养基30acetate,10mMTris-HClpH7.5,1mMEDTA1000g5A150100uL301-10mL的生理盐水中。吸取100uL细胞悬浮液于YPD（0.5ug/mLAureobasidinA）,302-310PCR中7个验证为阳性克隆子。[0034]4YSBD58[0035]75mLYPD301%过比较748小时时4号阳性简称CGMCC地址市朝阳区北辰西路1号院3号，中国微生物保藏编号为CGMCCNo.6921。[0037]5YSBD58[0041]从上述结果可以看出，YSBD58对革兰氏阳性菌和革兰氏菌都有抑制作用，并 10g/L20g/L20g/L0.1%30℃375rpm规模上对其酵母发酵和蛋白表达所需的各种条件进行了优化初步探索出一整套适合该工表达外源目标蛋白的最适条件利用该套发酵方法其中在菌体培养阶段菌体的