培养基的制备和灭菌

第三节

培养基的制备和灭菌培养基（medium，复数media；或culturemedium）

是指由人工配制的、适合微生物生长繁殖或产生代谢产物用的混合营养料。任何培养基都应具备微生物所需要的六大营养要素，其间的比例是合适的？碳源、氮源、能源、无机盐、生长因子、水link1绝大多数微生物都可在人工培养基上生长，只有少数难养菌（fastidiousmicroorganisms）至今无法在人工培养基上生长。难养菌是指寄生或共生的微生物，例如.类支原体（MLO）、类立克次氏体（RLO）和少数寄生真菌等。

（一）配制培养基的4个原则

1.目的明确

2.营养协调

3.理化适宜

4.经济节约

一、选用和设计培养基的原则和方法1.目的明确培养不同的微生物必须采用不同的培养条件；培养目的不同，原料的选择和配比不同；例如枯草芽孢杆菌：一般培养：肉汤培养基或LB（溶菌肉汤）培养基；自然转化：基础培养基；观察芽孢：生孢子培养基；产蛋白酶：以玉米粉、黄豆饼粉为主的产酶培养基；

根据不同的工作目的，微生物不同的营养需要，运用自己丰富的生物化学和微生物学知识来配制最佳的培养基。

对微生物细胞组成元素的调查或分析，是设计培养基时的重要参考依据。2.营养协调（1）调查和分析微生物细胞组成微生物细胞内各种成分间有一较稳定的比例。在大多数化能异养菌的培养基中，各营养要素间在量上的比例大体符合以下十倍序列的递减规律：要素：含量：H2O＞(～10-1)C源+能源＞

(～10-2)N源＞(～10-3)K、Mg＞(～10-5)P、S＞(～10-4)生长因子(～10-6)实验室的常用培养基：细菌：牛肉膏蛋白胨培养基（或简称普通肉汤培养基）；放线菌：高氏1号合成培养基培养；酵母菌：麦芽汁培养基；霉菌：查氏合成培养基；（2）选择适宜的营养物质1）根据培养微生物的种类选择相适应的培养基2）根据培养微生物的种类选择相适应的培养基实验室一般培养：普通常用培养基；遗传研究：成分清楚的合成培养基；生理、代谢研究：选用相应的培养基配方；营养物质的浓度适宜；营养物质之间的配比适宜；高浓度糖类物质、无机盐、重金属离子等不仅不能维持和促进微生物的生长，反而起到抑制或杀菌作用。（3）营养物质浓度及配比合适培养基中各营养物质之间的浓度配比也直接影响微生物的生长繁殖和（或）代谢产物的形成和积累，其中碳氮比（C／N）的影响较大。link2发酵生产谷氨酸时：碳氮比为4/1时，菌体大量繁殖，谷氨酸积累少；碳氮比为3/1时，菌体繁殖受到抑制，谷氨酸产量则大量增加。真菌需C／N比较高的培养基；（素食）细菌（动物病原菌）需C／N比较低的培养基；（荤食）NH3＞CO(NH2)2＞NH4NO3＞(NH4)2CO3＞(NH4)2SO4含氮量（82％）（46％）（35％）（29.2％）（21％）在同样重量时，在以上各氮源中含氮量以氨为最高，尿素次之，硝酸铵和碳酸铵更次之，而硫酸铵则最低。3.理化适宜指培养基的pH值、渗透压、水活度和氧化还原电势等物理化学条件较为适宜。pH渗透压和水活度氧化还原电位（1）pH各大类微生物都有其生长适宜的pH范围，培养基的pH必须控制在一定的范围内，以满足不同类型微生物的生长繁殖或产生代谢产物。细菌：pH7.0~8.0放线菌：pH7.5~8.5酵母菌：pH3.8~6.0霉菌：pH4.0~5.8藻类：pH6.0~7.0原生动物：pH6.0~8.0嗜极菌（extremophiles）初始pH通常培养条件：在微生物的生长、代谢过程中会产生引起培养基pH改变的代谢产物，为了维持培养基pH的相对恒定，通常要进行pH的调节。pH的内源调节pH的外源调节pH的调节（2）渗透压和水活度它表示两种浓度不同的溶液间被一个半透性薄膜隔开时，稀溶液中的水分子会因水势（waterpotentiality）的推动而透过隔膜流向浓溶液，直到浓溶液产生的机械压力足以使两边水分子的进出达到平衡为止，这时由浓溶液中的溶质所产生的机械压力，即为它的渗透压值。

渗透压（osmoticpressure）是某水溶液中一个可用压力来量度的一个物化指标。与微生物细胞渗透压相等的等渗溶液最适宜微生物的生长；高渗溶液会使细胞发生质壁分离；低渗溶液则会使细胞吸水膨胀，形成很高的膨压，这对细胞壁脆弱或丧失的各种缺壁细胞，例如原生质体、球状体或支原体来说，则是致命的。是一个比渗透压更有生理意义的一个物化指标。它表示在天然或人为环境中，微生物可实际利用的自由水或游离水的含量。水活度的定量涵义水活度即aw（wateractivity）（3）氧化还原电势（redoxpotential）又称氧化还原电位，是度量某氧化还原系统中还原剂释放电子或氧化剂接受电子趋势的一种指标。一般以Eh表示，它是指以氢电极为标准时某氧化还原系统的电极电位值，单位是V（伏）或mV（毫伏）。不同类型微生物生长对氧化还原电位的要求不同好氧性微生物：+0.1伏以上时可正常生长，以+0.3～+0.4伏为宜；厌氧性微生物：低于+0.1伏条件下生长；兼性厌氧微生物：+0.1伏以上时进行好氧呼吸，

+0.1伏以下时进行发酵。氧化还原电位与氧分压和pH有关,也受某些微生物代谢产物的影响增加通气量(如振荡培养、搅拌)提高培养基的氧分压，或加入氧化剂，从而增加Eh值；在培养基中加入巯基乙醇、抗坏血酸（Vc，0.1%）、硫化氢(0.025%)、半胱氨酸（<0.05%）、谷胱甘肽、铁屑、二硫苏糖醇、庖肉（瘦牛肉粒）等还原性物质可降低Eh值。测定氧化还原电势除用电位计外，还可在培养基中加入化学指示剂刃天青（resazurin）进行间接测定。在无氧条件下呈无色（Eh＝-40mV）；在有氧条件下，其颜色与溶液的pH相关；（中性——紫色；碱性——蓝色；酸性——红色）在微量氧时，它呈粉红色。刃天青（4）培养基的灭菌处理要获得微生物纯培养，必须避免杂菌污染，因此对所用器材及工作场所进行消毒与灭菌。对培养基而言，更是要进行严格的灭菌。对培养基一般采取高压蒸汽灭菌，一般培养基用1.05kg/cm,121.3℃条件下维持15～30min可达到灭菌目的。在高压蒸汽灭菌过程中，长时间高温会使某些不耐热物质遭到破坏，如使糖类物质形成氨基糖、焦糖，因此含糖培养基常在0.56kg/cm，112.6℃15～30min进行灭菌，某些对糖类要求较高的培养基，可先将糖进行过滤除菌或间歇灭菌，再与其他已灭菌的成分混合；

长时间高温还会引起磷酸盐、碳酸盐与某些阳离子（特别是钙、镁、铁离子）结合形成难溶性复合物而产生沉淀，因此，在配制用于观察和定量测定微生物生长状况的合成培养基时，常需在培养基中加入少量螯合剂，避免培养基中产生沉淀，常用的螯合剂为乙二胺四乙酸（EDTA）。4.经济节约配制培养基时应尽量利用廉价且易于获得的原料作为培养基成份,特别是在发酵工业中,以降低生产成本。（1）以粗代精（2）以“野”代“家”（3）以废代好（4）以简代繁（5）以氮代朊（6）以纤代糖（7）以烃代粮（8）以“土”代“洋”以野生植物原料代替栽培植物原料，如木薯、橡子、薯芋等都是富含淀粉质的野生植物，可以部分取代粮食用于工业发酵的碳源。（1）以粗代精对微生物来说，各种粗原料营养更加完全，效果更好。而且在经济上也节约。大量的农副产品或制品，如麸皮、米糠、玉米浆、酵母浸膏、酒糟、豆饼、花生饼、蛋白胨等都是常用的发酵工业原料（2）以“野”代“家”以工农业生产中易污染环境的废弃物作为培养微生物的原料。例如，糖蜜(制糖工业中含有蔗糖的废液)、乳清(乳制品工业中含有乳糖的废液)、豆制品工业废液、黑废液(造纸工业中含有戊糖和己糖的亚硫酸纸浆)等。工业上的甲烷发酵主要利用废水、废渣作原料,在我国农村，已推广利用粪便及禾草为原料发酵生产甲烷作为燃料。（3）以废代好（4）以简代繁减少营养物质也许会带来意想不到的效果。某制药厂改进链霉素发酵液中的原有配方，设法减去30-50%的黄豆饼粉、25%的葡萄糖和20%硫酸铵，结果反而提高了产量。（5）以氮代朊以大气氮、铵盐、硝酸盐或尿素等一类非蛋白质或非氨基酸廉价原料用作发酵培养基的原料，让微生物转化成菌体蛋白质或含氮的发酵产物供人们利用。（6）以纤代糖开发利用纤维素这种世界上含量最丰富的可再生资源。将大量的纤维素农副产品转变为优质饲料、工业发酵原料、燃料及人类的食品及饮料。（7）以烃代粮，以粮代烃以石油或天然气副产品代替糖质原料来培养微生物。生产石油蛋白；将石油产品转化成一些产值更高的高级醇、脂肪酸、环烷酸等化工产品和若干合成物；对石油产品的品质进行改良，如脱硫、脱蜡等；用糖类生产烃类化合物。（8）以“土”代“洋”以国产原料代替进口原料，尽量减少工业成本。国内青霉素发酵工业的迅速发展，依赖于找到了富有中国特色的培养基配方，即用廉价的棉子饼（或花生饼）和白玉米粉代替玉米浆和乳糖。（二）4种方法

1.生态模拟

直接取用这类天然基质（经过灭菌）或模拟这类自然条件，就可获得一个“初级的”天然培养基来培养相应的微生物。例如，用肉汤、鱼汁来培养细菌；用果汁来培养酵母菌；用润湿的麸皮、米糠培养霉菌；用米饭或面包来培养根霉；用肥土来培养放线菌；用玉米芯来培养脉孢菌（Neurosporaspp.）等。2.参阅文献（1）直接经验（2）查阅、分析和利用一切文献资料上的对自己直接或间接有关的信息中国期刊网（全文数据库）万方数据资源系统维普数据库生物引擎/生物通/生物桥/3.精心设计设计、试验新配方各项因素的比较或反复试验优选法或正交试验设计法工作量很大4.试验比较试验的规模一般都遵循由定性到定量、由小而大地逐步扩大的原则。生态模拟参阅文献精心设计试验比较设计一种优化的培养基

例如，先在培养皿琼脂平板上测试某微生物的营养要求，然后作摇瓶培养（shakeculture）试验，再进行台式发酵罐培养试验，最后才扩大到试验型发酵罐和生产型发酵罐的规模。二、培养基的配制配料溶解调pH过滤分装灭菌包扎摆斜面贮存碳氮比（C／N）比：碳源含量氮源含量碳氮比（C／N比）＝碳源中碳原子的摩尔数氮源中氮原子的摩尔数内源调节主要有以下两种方法：第一种是采用磷酸缓冲液进行调节。①pH的内源调节通过培养基内在成分所起的调节作用，就是pH的内源调节。调节K2HPO4和KH2PO4两者浓度比可获得pH6.0～7.6间的一系列稳定的pH。［K2HPO4］［KH2PO4］＝1时，溶液的pH稳定在6.8。反应原理：K2HPO4＋HCl→KH2PO4＋KClKH2PO4＋KOH→K2HPO4＋H2O第二种以CaCO3作“备用碱”进行调节。

CaCO3（不溶于水又是沉淀性的，在培养基中分布不均匀）、NaHCO3均可用来调节培养基的pH。反应是：②pH的外源调节这是一类按实际需要不断从外界流加酸或碱液，以调整培养液的方法。水活度某溶液的蒸汽压纯水蒸汽压aw＝该溶液的百分相对湿度值（ERH，equilibriumrelativehumidity）aw各种微生物生长繁殖范围的aw值在0.998～0.6之间。back11.配料

在容器中加入少量水按照配方正确称取各种