亲和色谱分离技术

生物技术及应用专业教学资源库4.5亲和色谱分离技术4.色谱分离技术基本原理1亲和色谱法的特点2亲和层析介质3影响亲和作用的因素4亲和色谱法的操作方法5亲和色谱分离技术亲和色谱法的应用6亲和色谱（affinitychromatography，AFC）利用固定相配基与生物大分子之间的特殊生物亲和力的不同实现分离的方法。

亲和色谱广泛用于酶、抗体、核酸、激素等生物大分子以及细胞、细胞器、病毒等物质的分离与纯化。特别是对分离含量极少而又不稳定的活性物质最有效，经一步亲和色谱即可纯化几百至几千倍。亲和色谱分离技术亲和色谱是应用生物高分子物质能与相应专一配基分子可逆结合的原理，将配基通过共价键牢固地结合于固相载体上制得亲和吸附系统。生物分子上具有特定构象的结构域与配体的相应区域结合，具有高度的特异性和亲和力。基本原理亲和色谱法的特点亲和色谱法的优点1.高选择性，待分离物质与配基专一性结合，分辨率高。2.具有浓缩作用，可纯化几千倍，适用于含量极少的活性物质分离，回收率高。3.操作条件温和，有效保持样品原有的生物学活性，适用于不稳定的活性物质的分离。亲和色谱法的特点亲和色谱法的缺点1.普遍性、通用性不够。2.费用高。载体应具备的条件：1.载体必须具有较好的理化稳定性和生物惰性，非专业吸附小。2.具有大量可供活化和配基结合的化学基团，以供与配基共价连接之用。3.载体必须具有高度的水不溶性和亲水性。4.载体必须有稀松的网状结构使大分子能自由进入。5.载体要有良好的机械性能，颗粒均匀。亲和层析介质亲和载体亲和层析介质由载体和配基组成亲和载体常用的亲和载体：主要有多孔玻璃载体、聚丙稀酰胺载体、纤维素载体、葡聚糖凝胶载体、琼脂糖凝胶和交联聚苯乙烯等。亲和层析介质配基应具备的条件：1.必须具有适当的化学基团以利于固定在载体上。2.配基的分子大小合适，以减小分离过程中的空间位阻效应。3.配基与被分离物质之间有足够大的亲和力，复合物能稳定一定时间。4.配基与被分离物质之间具有合适的特异性（专一性配基与特异性配基）。5.配基与待分离物之间的结合具有可逆性。亲和层析介质亲和配基配基的分类：按照配基的特性可分为有机小分子类、生物大分子类和染料化合物三类。按照配基的选择性，亲和色谱为配基又可分为专一性配基（仅对某种生物物质具有特别强的亲和性）和基团特异性配基（对某类化学基团或某一类生物分子具有结合作用）两类。亲和层析介质亲和配基常用的亲和配基：抗原抗体抗体与抗原之间具有高度特异性结合能力，因此可利用抗体或抗原为配基分离纯化相应的抗原或抗体，此种亲和色谱法又称免疫亲和色谱。利用免疫亲和色谱法，特别是以单抗为配基的免疫亲和色谱法是高度纯化蛋白质类生物大分子的有效手段。亲和层析介质亲和配基常用的亲和配基：蛋白质A和蛋白质G蛋白质A和蛋白质G与抗体的结构非常相似，可做为各种抗体的亲和配基。蛋白质A来源于金黄色葡萄球菌，蛋白质G分离自G群链球菌，与许多动物的免疫球蛋白的Fc片段具有很强的亲和结合作用。它们与抗体的结合并不影响抗体与抗原的结合，因此它们也可用于分离抗原-抗体的免疫复合体。蛋白质A和蛋白质G与不同种属来源的各种免疫球蛋白的亲和性不一。亲和层析介质亲和配基常用的亲和配基：凝集素外源凝集素是一种天然蛋白质，含有糖结合部位，与一些糖的残基或链段具有高度亲和力，可结合糖基。不同凝集素与糖结合的特异性不同。伴刀豆球蛋白A是常用的亲和配基，可用作糖蛋白、多糖、糖脂、各种含糖配基的生物大分子物质以及整个细胞、细胞表面受体蛋白和细胞膜片段的分离纯化。亲和层析介质亲和配基常用的亲和配基：酶抑制剂蛋白酶均存在抑制其活性的物质称酶抑制剂。具有特殊的结构，能够与酶的活性中心结合，从而抑制酶的活性。酶的抑制剂可以作为配基用于酶的分离纯化。亲和层析介质亲和配基常用的亲和配基：辅酶和磷酸腺苷某些酶需要在辅酶存在的情况下才能表现出催化活性，即辅酶能与脱氢酶和激酶之间通过亲和作用相互结合，因此这些辅酶可用作脱氢酶和激酶的亲和配基。主要的辅酶有NAD、NADP、ATP。亲和层析介质亲和配基常用的亲和配基：过度金属离子铜、镍、锌等可与氮、硫、氧等供电原子产生配位键，因此可与蛋白质表面的组氨酸的咪唑基、半胱氨酸的巯基和色氨酸吲哚基发生亲和结合作用。许多蛋白质和肽类分子表面都不同程度地含有暴露的组氨酸、半胱氨酸和色氨酸，这些氨基酸能与二价金属离子发生螯合作用。因此可利用金属螯合色谱得以分离纯化。亲和层析介质亲和配基常用的亲和配基：组氨酸组氨酸具有比较独特的性质，可与蛋白质发生亲和结合作用。在低盐和pH约等于目标蛋白质等电点的溶液中，固定化组氨酸的亲和吸附最强，随盐浓度的增大，亲和吸附作用降低。根据此特性，利用组氨酸为配基可亲和分离等电点相差较大的蛋白质。亲和层析介质亲和配基常用的亲和配基：色素配基三嗪类色素是一类分子内含有三嗪环的合成活性染料，与各种需要在NAD的存在下表现其生物活性的脱氢酶和激酶具有结合作用。这类色素与NAD的结合部位相同，具有抑制酶活性的作用。利用色素为配基的亲和色谱法一般称作色素亲和色谱。亲和层析介质亲和配基常用的亲和配基：其它配基肝素：为酸性多糖，具有抗凝血作用。与脂蛋白、脂肪酶、限制性内切酶、甾体受体、抗凝血酶、凝血蛋白质等具有亲和作用，可用作这些物质的亲和配基。多聚腺苷酸：用于信使RNA的结合蛋白、病毒RNA、与DNA有关的NRA酶、核酸抗体等生物活性物质的色谱分离。亲和层析介质亲和配基1.配基浓度对于亲和力低的系统，为了取得较好的配体分离效果，必须提高载体上配基的有效浓度。2.空间障碍在制备有些吸附剂时需要在载体与配基之间插入一段适当长度的多烃链“手臂”，以增加与载体相连的配基的活动度并减轻载体的立体障碍。影响亲和作用的因素3.配基与载体的结合位点在多肽或蛋白质等大分子作配基时，必须使它以最少的键与载体连接。4.载体孔径载体孔隙是配体向配基接近的运动通道，所以载体的孔径大小对吸附剂的亲和能力有决定性影响。影响亲和作用的因素1.配基固相化（样品制备、装柱、平衡）2.亲和吸附3.解吸附4.色谱柱再生亲和色谱法的操作方法1.配基固相化将与纯化对象有专一结合作用的物质，连接在水不溶性载体上，制成亲和吸附剂后装柱（称亲和柱），用一定pH和离子强度的缓冲液对柱子进行平衡。2.亲和吸附即进料和杂质清洗。将含有目标产物的料液连续通入亲和柱，目标产物吸附在柱上，之后用缓冲液淋洗色谱柱除去未被吸附的杂蛋白。亲和色谱法的操作方法3.解吸附

解吸附即目标产物洗脱。用某种缓冲液或溶液通过亲和柱，把吸附在亲和柱上的目的产物洗脱出来。亲和色谱法的操作方法4.色谱柱再生用几倍体积的起始缓冲液进行再平衡，一般足以使亲和柱再生，但一些未知的杂质往往仍结合在柱上，必须用苛刻的条件才能除去。根据载体材料的不同、配基的性质以及它与载体连接方式的不同可酌情处理。亲和色谱法的操作方法亲和色谱具有特异性强、分离条件温和、分离速度