药学专业毕业论文

金银花中绿原酸含量测定和指纹图谱研究进展

摘要:通过对近几年来金银花中主要有效成分绿原酸的含量测定方法和药材的指纹图谱进行综述,为今后的深入研究提供参考。

关键词:金银花绿原酸含量测定提取方法指纹图谱

金银花为忍冬科植物忍冬红腺忍冬山银花或毛花柱忍冬的干燥花蕾或带初开的花。该药为中医常用药，绿原酸为金银花的主要功能性成分，其药效高低取决于绿原酸的含量。绿原酸为咖啡酰奎尼酸衍生物，易溶于乙醇、丙酮，微溶于乙酸乙酯，是一种重要的生理活性物质，它具有抗菌、抗病毒、解热、升高白细胞、保肝利胆、免疫调节、抗肿瘤、降血压、降血脂、清除自由基等作用。笔者在本文中综述了金银花药材的指纹图谱研究进展及其主要有效成分绿原酸的含量测定方法，为今后的深入研究提供参考。

1含量测定方法

除中国药典规定的检测方法外，已见报道的分析方法有紫外分光光度法、导数光谱法、薄层层析法、阻抑一催化褪色光度法、毛细管区带电泳法、高效液相色谱法(HPLC法)等。

1.1紫外分光光度法

李娜等研究建立了金银花提取液中绿原酸含量的UV快速测定方法，经HPLC检验，该方法准确、快速、方便，紫外光谱中和绿原酸含量相关性最佳的波长点为294nm，绿原酸含量测定值和预测值之间具有良好的相关性(r=0．9952，n=l1)，此方法可用于清开灵注射液生产过程中金银花提取液的在线质量控制；由于绿原酸分子中含有酚羟基，张秋芳等根据酚类物质中酚羟基与三氯化铁的显色反应，发觉绿原酸与FeCl，的显色反应产物的光密度与绿原酸的含量呈良好的线性关系，因此建立了绿原酸含量的UV快速测定方法，此方法所得绿原酸含量皆高于HPLC法，但其差异皆<1O％，这可能是由于金银花中还会有少量其他物质也会与显色剂发生了显色反应，这提示在实际应用中，应根据不同产地金银花的成分及其含量高低等对此快速测定法的实测结果进行必要校正。

1.2差示导数光谱法

林黎明发现以钨酸钠为分析试剂，能快速与总绿原酸反应生成复合物，根据其光谱的特征性变化，采用差示导数分光光度法可不经分离直接测定金银花及其制剂银翘解毒片中的总绿原酸的含量．其平均回收率为100.4％，变异系数为1.82％。方法简便，快速，准确。

1.3导数极谱法

李白林研究了绿原酸在柠檬酸介质中的电化学行为和绿原酸含量的线性扫描二阶导数极谱法测定，发现在NH-NHCl介质中，绿原酸不稳定，易分解，导致较大的分析误差。而在柠檬酸钠介质中，对金银花浸取液和银黄注射液进行绿原酸含量的测定，获得令人满意的结果。

1.4薄层色谱扫描法

徐强等以薄层扫描法测定咽爽袋泡剂中金银花中的绿原酸的含量，用薄层扫描仪进行光谱扫描后，确定以三氯甲烷一醋酸乙酯一甲酸(2：2：1)为展开剂，双波长反射法锯齿扫描，此方法简便，测定准确；魏云等l也采用了薄层扫描法对金银花中绿原酸进行了测定，样品提取条件经试验表明，甲醇、7O％乙醇使斑点容易扩散，使用乙醇提取效果较好，薄层条件经比较，选用氯仿一醋酸乙酯一甲酸(4：4：2)为展开剂能达到较好的分离效果，锯齿形反射法双波长扫描，325nm，R4OOnm，扫描速度20ram／rain，狭缝1．25ram×1．25ram，记录仪灵敏度×2，线性参数×3；李宗等用聚酰胺薄膜分离绿原酸，用薄层扫描法测定其含量，为金银花及其制剂海菊冲剂的质量控制提供了一个新的方法。利用聚酰胺薄膜对绿原酸进行分离和定量，色谱峰形好，消除了绿原酸在硅胶薄层上的拖尾现象。

1.5阻抑一催化褪色光度法

在盐酸介质中，铁(Ⅲ)能灵敏地催化过氧化氢还原亮绿sF的反应，绿原酸对催化反应有灵敏的阻抑作用，耿玉珍等1据此建立了测定痕量绿原酸的阻抑-催化动力学光度分析方法。该方法测定绿原酸的线性范围为0-0.12mg／L；检出限为4.2×l0g／L。对浓度为0.08mg／L绿原酸标准溶液6次平行测定的相对标准偏差为3.8％；回收率为93.4％～1O5％，同时考察了反应的最佳条件和动力学参数，探讨了反应机理，该方法用于测量金银花浸取液中绿原酸的含量，取得了较为满意的结果。

1.6毛细管区带电泳法

毛细管电冰分析具有分辨率高、分析速度快及环境友好等优点，近年来已成为中药质量研究中的一种广泛、有效的分析技术。颜流水等采用微波辅助萃取金银花中的有效成分，用熔融石英毛细管柱(64.5cm×50m，有效长度56cm)作为分离通道；以30mmol·L硼砂(pH=9．3)为运行缓冲溶液；分离电压20RV；毛细管柱温25℃；检测波长340nm(绿原酸)和270nm(芦丁、槲皮素)同时分离和测定金银花中芦丁、绿原酸和槲皮素的含量，为全面有效控制金银花药材质量提供一种简便、快速方法；龙虹等提出了一种测定金银花和含金银花的八种中成药中绿原酸标志物的毛细管区带电泳分析方法。所用的背景电解质为含有lOmmol／L磷酸盐和20retool／L硼酸盐的pH7.00的缓冲溶液，并含有5％的乙醇以提高样品的溶解度。测定的线性范围在27.765～665ug／mL，相关系数r0.9996。测定金银花和含金银花的8种中成药中的绿原酸可以在15rain内完成。这种分析方法简单、快速、适用面广。

1.7高效液相色谱法

目前测定金银花中绿原酸含量的主要方法还是高效液相色谱法。刘明斌等用流动相：乙腈-0.1％磷酸(20：8O，v／v)；流速：0.8ml／min，检测波长：327nm，进样量：1Oul；柱温：室温，在ODS柱上比较三种不同产地的金银花中绿原酸的含量，并鉴别出含绿原酸含量较高的品种，结果发现隆回县金银花绿原酸含量较高，河南密县金银花绿原酸含量较低，山东临沂地区平邑县金银花绿原酸含量更低；刘恩荔等采用HypersilODS2色谱柱，以乙腈：水：冰醋酸(15：85：0.2)为流动相，流速0.8ml／min，检测波长327nm，柱温25℃建立测定金银花有效部位中绿原酸含量的高效液相色谱法，作者比较了不同比例的冰醋酸，结果表明，当冰醋酸的浓度为0.2％时，可得到较好的色谱峰峰形；王天志等建立了用反相高效液相色谱内标法梯度洗脱，同时测定金银花中绿原酸、咖啡酸、3，5一二咖啡酰奎尼酸含量的方法，并对4个产地3种金银花中上述3种化合物进行定晕分析。方法：采用岛津CLC-ODS柱(6.0ram×150ram)，甲醇-1O％的磷酸氢二钠和醋酸缓冲液流动相不同比例进行梯度洗脱，内标物为水杨酸，检测波长304nm。结果发现西南地区金银花药材主流商品灰毡毛忍冬、细毡毛忍冬干燥花蕾中绿原酸、咖啡酸、3，5-二咖啡酰奎尼酸含量高于山东、河南产金银花。本法灵敏快速，准确可靠。

2金银花指纹图谱

中药指纹图谱为在给定的色谱条件下，药材中各组分的相对保留时间和相对峰面积为各组分所特有，如同人的指纹，利用相对保留时间和相对峰面积建立样品的相对保留值指纹谱．通过对样品色谱的数据化可产生一系列的参数，包括强峰、特征峰群及特征指纹峰检出率等，为鉴定和区分中药材的品质提供客观依据。目前金银花的指纹图谱研究有GC法，HPLC法，HPCE法等。

2.1GC法

田吉等采用岛津GC-14B；CR-7Aplus数据处理器；SE-30石英毛细管柱(25m×0．22mm)；柱温90℃初温，以4℃／min升至200℃，40℃／min升至240℃保持；载气：高纯氮气1.2ml／min；补充气：氮气40ml／min，分流比1：10；氢气40ml／min；空气500ml／min；检测器FID；检测室245℃；气化室235℃，建立了金银花药材的气相色谱指纹图谱。该法以芳樟醇为参照物，对11批金银花进行分析，发现其中24个峰为各批次共有的特征峰，选择为共有指纹峰。得到金银花药材的气相指纹图谱。芳樟醇色谱峰分离度好．强度高，故选为参照物峰。以芳樟醇峰的保留时间及峰面积为1，计算其他各共有指纹峰的相对保留时间和峰面积比值，并对占总峰面积10％以上的峰计算峰面积比值差值，得到金银花气相指纹图谱技术参数。结果表明金银花气相指纹图谱稳定性、重现性好、特征性强、峰面积比值及其差值、非共有峰面积均符合规定，结果稳定可靠，可作为注射用金银花药材的鉴别标准之一。王斌等应用GC色谱法建立了中药金银花的指纹图谱，并对相似度计算软件应用过程中某些问题进行了探讨。方法：使用SGE30QC3石英毛细管柱(30m×0.32ram×0．5)；柱温：初温100℃，以2℃／min升至150℃，5℃／1min升至170℃保持4min；载气：高纯氮气，流量：1.0ml／min；尾吹气：氮气，40ml／min，分流比1：10；氢气，40ml／min；空气，400ml／min；检测器：FID；检测器温度：200℃；气化室温度：200℃。从此方法建立了药材GC指纹图谱共有模式，并对不同批药材进行了相似度比较，药材各成分得到了很好的分离，可作为该药材的指纹图谱。2.2HPCE法

容蓉等以40mmoL／L硼砂溶液为缓冲液，利用高效毛细管电泳法，建立不同产地金银花的HPCE指纹图谱。石英毛细管：57cmx75m(有效长度50cm)，工作电压为17kV，温度为25℃，压力进样时间为6S，检测波长：214nm。通过对指纹图谱特征峰数据进行聚类分析，将不同产地的药材分为3类,并对各类样品建立判别函数。利用指纹图谱技术，通过聚类分析或建立判别函数，可以对不同产地的金银花药材进行判别和质量控制；孙国祥等采用毛细管区带电冰法，以50mmol／L硼砂(含20mmol／L-环糊精，用磷酸调pH8．0)为背景电解质，运行电压12kV，紫外检测波长254nm，重力进样l5s(高度8.5cm)，建立了金银花药材水提取液的毛细管电泳指纹图谱。将l3个不同产地的金银花药材供试液的毛细管电泳指纹图谱进行比较，以电泳峰出现率100％计，确定金银花的共有指纹峰为l8个，该方法具有较好的精密度和重现性，分离效能高且成本低廉。

2.3HPLC法

白雪梅等采用HPLC法建立金银花的指纹图谱。色谱条件为：色谱柱YGW-C18(250mmx4.6mm，10m)，检测波长238nm，柱温30℃，流动相：A液-0．4％磷酸水溶液，B液-乙腈，进样量为20ul，进行梯度洗脱，所有组分在40min内出峰，并对4个产地金银花中所含的组分进行综合评价并测定其绿原酸含量。结果为4个产地金银花指纹谱主要特征大致相同，金银花主要成分之一绿原酸含量与对照药材相比无显著性差异(p>0．05)；阳利龙以绿原酸为参照物，对产于山东2003～2004年不同采集时间的10批忍冬金银花进行甲醇提取物HPLC指纹图谱方法的建立。色谱柱为ODS，(4.6mm×250mm，)，流动相：乙腈：0.4％磷酸(15：85)，柱温：30℃，流速：1mL／min，检测波长：307nm。结果为药材有15个共有峰，其参数符合中药注射剂指纹图谱技术要求的有关规定，可以作为金银花质量评价和品种鉴剐的重要依据之一；王倩等用梯度洗脱法，对金银花药材进行HPLC测定。条件为：色谱柱Z0RBAXSB-C18(150mm×4．6mm)；流动相：A相为1％醋酸水溶液，B相为甲醇进行梯度洗脱；流速：1.0mL／min；检测波长：254mn；柱温：30℃。运用梯度洗脱能很好分离金银花的各类成分，经方法学考察，HPLC指纹图谱具有良好的重现性，l0批样品中1个特征指纹峰有专属性，此研究建立的金银花药材HPLC指纹图谱分析法可用于金银花药材质量的综合评价。基于C8051F单片机直流电动机反馈控制系统的设计与研究基于单片机的嵌入式Web服务器的研究MOTOROLA单片机MC68HC（8）05PV8/A内嵌EEPROM的工艺和制程方法及对良率的影响研究基于模糊控制的电阻钎焊单片机温度控制系统的研制基于MCS-51系列单片机的通用控制模块的研究基于单片机实现的供暖系统最佳启停自校正（STR）调节器单片机控制的二级倒立摆系统的研究基于增强型51系列单片机的TCP/IP协议栈的实现基于单片机的蓄电池自动监测系统基于32位嵌入式单片机系统的图像采集与处理技术的研究基于单片机的作物营养诊断专家系统的研究基于单片机的交流伺服电机运动控制系统研究与开发基于单片机的泵管内壁硬度测试仪的研制基于单片机的自动找平控制系统研究基于C8051F040单片机的嵌入式系统开发基于单片机的液压动力系统状态监测仪开发模糊Smith智能控制方法的研究及其单片机实现一种基于单片机的轴快流CO〈,2〉激光器的手持控制面板的研制基于双单片机冲床数控系统的研究基于CYGNAL单片机的在线间歇式浊度仪的研制基于单片机的喷油泵试验台控制器的研制基于单片机的软起动器的研究和设计基于单片机控制的高速快走丝电火花线切割机床短循环走丝方式研究基于单片机的机电产品控制系统开发基于PIC单片机的智能手机充电器基于单片机的实时内核设计及其应用研究基于单片机的远程抄表系统的设计与研究基于单片机的烟气二氧化硫浓度检测仪的研制基于微型光谱仪的单片机系统单片机系统软件构件开发的技术研究基于单片机的液体点滴速度自动检测仪的研制基于单片机系统的多功能温度测量仪的研制基于PIC单片机的电能采集终端的设计和应用基于单片机的光纤光栅解调仪的研制气压式线性摩擦焊机单片机控制系统的研制基于单片机的数字磁通门传感器基于单片机的旋转变压器-数字转换器的研究基于单片机的光纤Bragg光栅解调系统的研究单片机控制的便携式多功能乳腺治疗仪的研制基于C8051F020单片机的多生理信号检测仪基于单片机的电机运动控制系统设计Pico专用单片机核的可测性设计研究基于MCS-51单片机的热量计基于双单片机的智能遥测微型气象站MCS-51单片机构建机器人的实践研究基于单片机的轮轨力检测基于单片机的GPS定位仪的研究与实现基于单片机的电液伺服控制系统用于单片机系统的MMC卡文件系统研制基于单片机的时控和计数系统性能优化的研究基于单片机和CPLD的粗光栅位移测量系统研究单片机控制的后备式方波UPS提升高职学生单片机应用能力的探究基于单片机控制的自动低频减载装置研究基于单片机控制的水下焊接电源的研究基于单片机的多通道数据采集系统基于uPSD3234单片机的氚表面污染测量仪的研制基于单片机的红外测油仪的研究96系列单片机仿真器研究与设计基于单片机的单晶金刚石刀具刃磨设备的数控改造基于单片机的温度智能控制系统的设计与实现基于MSP430单片机的电梯门机控制器的研制基于单片机的气体测漏仪的研究基于三菱M16C/6N系列单片机的CAN/USB协议转换器基于单片机和DSP的变压器油色谱在线监测技术研究基于单片机的膛壁温度报警系统设计基于AVR单片机的低压无功补偿控制器的设计基于单片机船舶电力推进电机监测系统基于单片机网络的振动信号的采集系统基于单片机的大容量数据存储技术的应用研究基于单片机的叠图机研究与教学方法实践基于单片机嵌入式Web服务器技术的研究及实现基于AT89S52单片机的通用数据采集系统基于单片机的多道脉冲幅度分析仪研究机器人旋转电弧传感角焊缝跟踪单片机控制系统基于单片机的控制系统在PLC虚拟教学实验中的应用研究基于单片机系统的网络通信研究与应用基于PIC16F877单片机的莫尔斯码自动译码系统设计与研究基于单片机的模糊控制器在工业电阻炉上的应用研究基于双单片机冲床数控系统的研究与开发基于Cygnal单片机的μC/OS-Ⅱ的研究基于单片机的一体化智能差示扫描量热仪系统研究基于TCP/IP协议的单片机与Internet互联的研究与实现变频调速液压电梯单片机控制器的研究基于单片机γ-免疫计数器自动换样功能的研究与实现基于单片机的倒立摆控制系统设计与实现单片机嵌入式以太网防盗报警系统基于51单片机的嵌入式Internet系统的设计与实现单片机监测系统在挤压机上的应用MSP430单片机在智能水表系统上的研究与应用基于单片机的嵌入式系统中TCP/IP协议栈的实现与应用单片机在高楼恒压供水系统中的应用基于ATmega16单片机的流量控制器的开发基于MSP430单片机的远程抄表系统及智能网络水表的设计基于MSP430单片机具有数据存储与回放功能的嵌入式电子血压计的设计基于单片机的氨分解率检测系统的研究与开发锅炉的单片机控制系统基于单片机控制的电磁振动式播种控制系统的设计基于