DB5206T81-2018红薯脱毒种薯检验规程

ICS65.020B30铜仁市DB5206地方标准DBT18代替DB522200/T62-2009铜仁市质量技术监督局发布IDB5206/T81－2018目次前言 IIDB5206/T81－2018前言本标准按照GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》给出的规则起草。请注意：本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准代替DB522200/T62-2009《红薯脱毒种薯检验规程》。主要变化是进行编辑性修本规程由铜仁市农业委员会提出并归口。本规程起草单位：铜仁市种子管理站。本规程参加单位：思南县农牧科局、松桃县种子管理站、沿河县种子管理站、石阡县种子管理站、印江县种子管理站、万山区种子管理站、玉屏县种子管理站、德江县种子管理站江口县种子管理站、本规程主要起草人：李朝霞、李永凤、甘坤俊、罗会群、邓娅、代洪江、冉小芳、安兴智、张羽军、王显权、廖雪红、石俊、陈正福、陈忠本标准的历次版本发布情况为：──DB522200/T62-2009。1DB5206/T81－2018红薯脱毒种薯检验规程1适用范围本规程规定了各级红薯脱毒种薯(苗)的质量标准、检验方法、判定规则。本规程适用于红薯脱毒种薯(苗)繁育、生产、销售过程中的质量鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。NY/T1200甘薯脱毒种薯3术语和定义下列术语和定义适用于本规程。3.1脱毒试管苗应用茎尖分生组织培养技术获得，经检测确认不带红薯羽毛状斑驳病毒、红薯潜隐病毒、红薯褪绿斑病毒的试管苗。3.2脱毒种薯(苗)从育种家种子繁殖试管苗开始，经逐代繁殖增加脱毒种薯(苗)数量的种薯生产体系生产出来的种薯(苗)。分为育种家种子、原原种、原种、生产用种四个级别。3.2.1育种家种子由育种家直接生产和掌握的原始种子，具有该品种的典型性和遗传稳定性，纯度100%，不带病毒和其它病虫害，产量及其它主要性状符合推广时的原有水平。3.2.2原原种：用育种家种子或典型品种的脱毒试管苗在防虫网室、温室条件下生产的符合质量标准的种薯苗。3.2.3原种：用原原种作种薯，在良好隔离条件下生产的符合质量标准的种薯(苗)。3.2.4生产用种：用原种作种薯，在良好隔离条件下生产的符合质量标准的种薯(苗)。3.3病虫害允许率指脱毒种薯(苗)繁殖田中病害株比率和虫害株比率。3.3.1病害株：主指脱毒种薯(苗)病毒病株、真菌病株、细菌病株的比率。2DB5206/T81－20183.3.2虫害株：主指脱毒种薯(苗)虫害株比率。3.4混杂株允许率主指脱毒种薯(苗)繁殖田中混杂其它红薯品种植株比率。3.5薯块整齐度单块质量在100g—500g的块根质量占块根总质量的比率。3.6有缺陷薯指机械损伤、虫鼠伤、畸形块根质量占块根总质量的比率。3.7杂质指浮土、块根上所沾的泥土、无种用价值的块根，以及其他有机、无机质量。4控制和汰除的病害4.1控制的病害指通过控制病害的发生程度以达到脱毒种薯(苗)质量要求的病害。主指红薯的病毒病(即红薯羽状斑驳病毒、红薯潜陷病毒、红薯褪绿病毒)、黑斑病、疮痂病、蔓割病、茎线虫病。4.2汰除的病虫害指不能在达到质量要求的脱毒种薯(苗)上发生的病虫害。包括：根结线虫病、细菌性萎蔫病(红薯瘟)、根腐病、红薯蚁象。5质量要求5.1各级别脱毒种薯(苗)繁殖田中带病植株允许率应符合附录A表A.1要求。5.2各级别脱毒种薯块根质量指标应符合附录A表A.2要求。6检验方法6.1脱毒苗的检验某一品种经茎尖分生组织获得一批组培再生苗后，要逐株鉴定带病毒状况，经检测确认不带红薯羽毛状斑驳病毒、红薯潜隐病毒、红薯褪绿斑病毒的组培苗才能确认是脱毒苗。检测方法：有目测法、指示植物确认法、血清法(酶联免疫检测)。6.1.1目测法目测法是根据红薯叶片和薯块上出现的典型症状判断红薯是否感染病毒。红薯病毒病的症状主要包括：(1)叶斑型：主要有紫色羽状斑、紫斑、紫环斑、黄色斑或者枯斑。(2)花叶型：苗期感病后，初期叶脉呈网状透明，然后沿叶脉出现不规则黄绿相间的花叶斑纹。3DB5206/T81－2018(3)卷叶型：叶片边缘上卷，严重者可形成杯状。(4)叶片皱缩型：病苗叶片较小，皱缩，叶缘不整齐，甚至扭曲畸形。(5)叶片黄化型：包括叶片黄化及网状黄脉。薯块上的症状主要是产生黑褐色或黄褐色龟裂纹。病毒病的症状可因病毒种类、红薯品种以及环境条件等因素的影响而改变，根据症状只能作初步判断。另外，目测法应注意区分红薯品种特性以及由于土壤水份多、营养失调等原因造成的生理病害与病毒病症状的差异。6.1.2指示植物法常用巴西牵牛(Ipomoeasetosa)作指示植物，几乎所有侵染红薯的病毒都能感染巴西牵牛，因此，将薯苗嫁接在巴西牵牛上，从巴西牵牛的显症情况可判断薯苗是否带毒。具体嫁接方法如下：以薯苗芽尖作接穗，将芽尖削成楔形，将具3-4片真叶的巴西牵牛作砧木，在其茎中部切一斜口把楔形接穗插入，用封口膜扎住，置防虫网室内遮阴保湿3-4d，然后在自然光照下观察记载牵牛的显症情况，一般嫁接后25~30d左右开始出现症状,显症初期新生叶出现系统性明脉，以后发展为花叶或皱缩等症状。6.1.3血清学检测常用的血清学检测方法为酶联免疫吸附法，它具有快速和能检测大量样品的特点，在大量检测样品时较常应用。具体检测方法如下：cmgml液，迅速研磨，置于离心管中，取上清液供检测用。(2)点样：将NC膜在TBS(20mMTris-HCl,pH7.5,150mMNaCl,)中充分湿润，然后放在一张干燥滤纸上，让其稍事干燥，用铅笔作好记号，用微量取样器进行点样，点样后(a)封闭:将点样后的NC膜转入封闭液(TBST+5%脱脂奶粉)中封闭1小时或4℃封闭过夜。夜(b)第一抗体反应:封闭后的NC膜用TBST(20mMTris-HCl,pH7.5,150mMNaCl,0.05%Tween-20)漂洗2-3次,每次5-10min,加入用TBST稀释的病毒专化抗血清(1:2000)37℃(c)第二抗体反应:加入TBST稀释的碱性磷酸酯酶标记的羊抗兔IgG(1:5000),37℃保酯酶缓冲液(100mMTris-HCl,pH9.5,100mMNaCl,5mMMgCL2)中显色至样点清晰,将膜放入蒸馏水中漂洗,终止显色反应。取出晾干,拍照。6.2脱毒试管苗种性鉴定法：将脱毒试管苗种植在防虫网室内，每株系种植3株，对照原品种特征特性，剔除变异株系和混杂株系，收获时检验块根质量，与原品种一致的株系进行扩大繁殖。6.3扩繁苗的检验随机抽取1%∽2%脱毒试管苗经目测法淘汰弱苗和显症苗后，再进行指示植物确认，经指示植物检测为不显症或为阴性后，方可用于扩繁，若指示植物检测中有一株为阳性，都不能进行扩繁，还要再进行血清法(酶联免疫检测)不显症后，方可用于扩繁。4DB5206/T81－20186.4不同级别脱毒苗的检测方法6.4.1茎尖苗的检测茎尖苗的检测：首先采取目测法淘汰弱苗和显症苗(因为脱毒茎尖苗和带毒茎尖苗在形态、长势上有明显差异，前者生长快、叶片平展、植株较健壮；后者长势弱，叶片上常出现花叶、明脉和褪绿斑等症状)。然后再用血清学(酶联免疫检测)方法进行筛选，呈阴性的样品再进行嫁接。每个茎尖苗一般嫁接3-5株，有1株发病即认为该样品带病毒，待筛选出都不发病的样品才可重复嫁接。6.4.2原原种田的检测原原种田的检测：首先在防虫网室内种植原原种和若干株巴西牵牛，定期观察巴西牵牛是否显症、以判断是否有蚜虫传毒；对原原种田还要进行定期普查，及时淘汰显症株和变异株；另外对原原种田要定期取样，用嫁接指示植物法或酶联免疫检测法进行检测，以判断原原种田病毒的感染情况，对于病毒感染率超标的繁种田要降级使用。6.4.3原种田的检测脱毒原种的繁殖要在有一定隔离区的地方进行，即周围500m内不能种植非脱毒薯。原种田的病毒检测以目测法和田间种植巴西牵牛为主，必要时田间取样用酶联免疫检测病毒的感染率。6.4.4生产种田的检测生产种田的病毒检测以目测法为主，定期对生产种田的发病率进行调查，必要时也可抽样用酶联免疫检测，当发病率超过一定标准时就不能再作为种薯使用。6.5不同级别脱毒苗的判定标准根据不同级别脱毒苗对病毒感染率的不同要求，初步制定以下判断标准，病毒感染率超过一定标准的应降级使用(见附录A表A.3)。6.6田间检验要求6.6.1详细了解受检单位脱毒红薯种薯扩繁基地的基本情况，包括基地繁殖面积、隔离情况、海拔高度、种薯来源(有无质量报告单)、田间生长情况、品种纯度，是否建立生产档案以及影响种薯质量的主要病害类型和发病率。6.6.2检验时间：原原种和原种整个生育期间进行三次检验，分别于分枝期、封垄前、收获前2周。生产用种检验二次，分别于封垄前、收获前2周。检验鉴定标准见表1。由繁种单位检验，并做好记录报检验部门备案，确需复查时，由检验部门派合格检验员复核检验。6.6.3抽样方法和数量检测人员对田间生长的植株作整体观察后，依据随机抽样法确定抽样点，其抽样方法和6.6.4检验内容红薯植株的主要病害与纯度。6.6.4.1植株的主要病害：检查典型的病毒病、细菌与真菌发病症状。其主要发病症状目6.6.4.2纯度：检查品种的植物学形态特征：茎的颜色、叶的形态，薯皮、薯肉颜色，薯5DB5206/T81－2018块形状等品质，找出杂株。6.6.4.3计算结果分检验项目按以下公式计算6.7脱毒种薯(苗)块根质量检验经过植株检验的种薯(苗)必须进行块根质量检验，检测方法应符合块根抽样数量标准块根质量检验抽样方法：根据块根抽样数量标准要求，重点检测块根杂质、薯块整齐度、有无缺陷薯、有无细菌性萎蔫病(红薯瘟)、有无黑斑病、有无蔓割病、有无根腐病、有无软腐病、有无镰刀菌干腐病和腐烂、有无茎线虫病、有无根结线虫病、有无红薯蚁象以及能表现该品种特征特性的种薯纯度，并将各种测定结果换算成百分率。7判定规则7.1脱毒种薯(苗)分级以繁殖田播种的种薯级别、带病植株比率、混杂植株比率为定级标准。7.2病毒病、蔓割病、黑斑病、茎线虫病、疮痂病以及混杂植株比率六项质量指标，任何一项不符合原来级别质量标准但又高于下一级别质量指标者，判定结果均按降低一级定级别，只要检出根腐病、根结线虫病、红薯瘟、红薯蚁象，皆不能作种用。注：各种病害症状7.3经田间植株检验和块根质量检验合格后，签发红薯脱毒种薯质量合格证书见附录A表A.8。6DB5206/T81－2018(资料性附录)标准中的记录表表A.1各级别脱毒种薯(苗)繁殖田中带病植株允许率表A.1各级别脱毒种薯(苗)繁殖田中带病植株允许率检验时期种薯级别病害及混杂株率(%)病毒病红薯瘟根腐病根结线虫病红薯蚁象黑斑病疮痂病蔓割病茎线虫病混杂株率分枝期检验育种家种子0000000000原原种0000000000原种≤5.00000≤5.00≤1.00≤1.0生产用种≤10.00000≤8.0≤5.0≤2.0≤1.0≤4.0封垄前检验育种家种子0000000000原原种0000000000原种≤3.00000≤3.00≤1.00≤0.5生产用种≤10.00000≤5.0≤3.0≤2.0≤1.0≤2.0收获周检验育种家种子0000000000原原种0000000000原种≤2.00000≤1.00≤1.00≤0.5生产用种≤10.00000≤2.0≤1.0≤2.0≤1.0≤2.0注：种苗质量应符合分枝期检验质量指标。7DB5206/T81－2018表A.2各级别脱毒种薯块根质量指标表A.2各级别脱毒种薯块根质量指标项目允许率(%)育种家种子原原种原种生产用种纯度100.0100.0＞99.5＞98.0薯块整齐度≥90.0≥90.0≥85.0≥85.0有缺陷薯≤1.0≤1.0≤3.0≤5.0杂质≤1.0＜2.0＜2.0＜2.0软腐病000＜1.0黑斑病00≤1.0≤2.0茎线虫病000≤1.0根结线虫病0000红薯蚁象0000根腐病0000红薯瘟0000表A.3红薯脱毒苗病毒检测方法及判定标准(试行)表A.3红薯脱毒苗病毒检测方法及判定标准(试行)种苗级别检测方法取样方法检样数量重复次数判断依据检测标准备注试管苗a.血清法(酶联免疫检测)b.指示植物法试管苗2a.血清学检测b.嫁接所有重复均不显症为0原原种苗b.血清法c.指示植物法样普查2嫁接不显症或血清反应阴性目测显症率为0；血清及指示植物阳性率小用目测显症率大用于0.1%者可降级为原种使。原种苗b.血清法c.指示植物法样多点普查2目测显症率小指示植物阳性率小于1%.用显症率大于用1.0%者可降级为生产种使。生产种苗b.血清法随机多点取样3-5依症状判断目测显症率小8DB5206/T81－2018表A.4育种家种子、原原种和原种不同面积田块的检验点数和植株数表A.4育种家种子、原原种和原种不同面积田块的检验点数和植株数检验点数和每点检验植株数≤0.10.11~1每个点100株，超过1hm划出另一检验区，按本检验标准规定的不同面积的检验点取样。表A.5生产用种不同面积田块的检验点数和植株数表5生产用种不同面积田块的检验点数和植株数面积，hm检验点数和每点检验植株数≤0.10.11~11.1~5株。随机抽样检验10个点，每个点100株，超过5hm划出另一检验区，按本检验标准规定的不同面积的检验点取样。表A.6检验记录表A.6检验记录：检验日期：年月日观察记载项目各类病株数检验员(签字)备注细菌性萎蔫病黑斑病疮痂病蔓割病根腐病根结线虫病茎线虫病软腐病镰刀菌干腐病红薯蚁象12345合计%9DB5206/T81－2018表A.7脱毒种薯块根抽样数量标准表表A.7脱毒种薯块根抽样数量标准表种类总量抽样百分率%抽样最低数量种薯≤10000kg＞10000kg6~103~5100kg注：不足抽样最低数量的全部作为混合样品。表A.8红薯脱毒种薯质量检验合格证书表A.8红薯脱毒种薯质量检验合格证书年月日红薯脱毒种薯质量检验合格证书编号：种薯生产单位：种薯级别：品种名称：上述种薯经按铜仁市地方标准(DB5222/T83-2018《红薯脱毒种薯检验规程》)检验合格，特发此证。检验人：检验机关：(签字)(印章)表A.9红薯种薯(苗)田间带病植株症状表A.9红薯种薯(苗)田间带病植株症状病害名称植株块根细菌性萎蔫病(红薯瘟)从育苗至结薯均能发病。晴天中午，病苗顶部叶片萎蔫，茎基黑褐色水烂症状，维管束从下而上黄褐色条纹症状，严重时茎内全部腐烂，成株发病，叶色暗淡无光泽，蔓出现水渍症状斑点且呈黑褐色，剖视维管束，褐色条纹用手拉易脱皮，留下纤维。轻病薯块乳汁明显减少，有苦臭味，煮不烂，外表症状常不明显，仅薯蒂附近呈黑褐色或尾根呈不同程度病变，剖开横切面为分散的小斑点或黄褐色至深褐色斑块，重症薯块，整块呈黑褐色腐烂或一端腐烂，有脓液状或淡黄色菌液，臭味很重。黑斑病茎基部形成黑褐色梭形或椭圆形病斑，病斑初期有灰色霉层，后变成黑色粉状物，病斑逐渐扩大，重者基部全部变黑至枯死。薯块上形成黑色圆形病斑，病部轮廓清晰，组织坚实，薯肉呈青褐色或黑褐色，有苦味和强烈的臭味，病部木栓化，坚硬、干腐，在适当条件下病斑中央会长出黑色子囊壳。疮痂病叶片卷皱、嫩芽僵缩，茎蔓和叶柄生出无数凹凸不平的粗糙病斑，顶芽受害病斑初为透明深红色，扩大后逐渐变黑呈褐色而枯死，新梢和幼叶不能长大，整个顶梢收缩僵硬而直立，表现粗糙。不表现症状DB5206/T81－2018表A.9红薯种薯(苗)田间带病植株症状(续)病害名称植株块根茎线虫病苗期：发病重的出苗少、矮小、发黄，剖视茎基部，内有褐色空隙，剪断后不流或流出的白浆狠少，后期侵入部位表皮形成小口，剪断后无白浆。茎蔓症